楊樹花口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

賈紀(jì)萍,陳曉蘭,金禮琴,丁 寧,丁詩晴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

楊樹花為楊柳科植物毛白楊、加拿大楊或同屬數(shù)種植物的干燥雄花序,楊樹花口服液為楊樹花經(jīng)提取制成的合劑[1],為紅棕色的澄明液體,主要藥用成分為酚苷類化合物和黃酮類化合物[2],化學(xué)成分包括芹菜素、山奈酚、水楊苷、木犀草素等[3]。楊樹花口服液功能是清熱解毒、澀腸止瀉、化濕止痢、健脾養(yǎng)胃,用于馬、牛、羊、豬等,可提高仔畜存活率,主要用于治療仔豬濕熱下痢[4]。

《中華人民共和國獸藥典》(二〇一五年版,二部)中收載的楊樹花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中【鑒別】項下只有與楊樹花對照藥材的薄層色譜鑒別,缺少其中有效成分的薄層鑒別和含量測定,其他關(guān)于楊樹花口服液檢測的文獻資料也較少,不能有效控制目前市場上楊樹花口服液的質(zhì)量。本研究對楊樹花口服液中芹菜素等有效成分進行深入分析,以期為完善楊樹花口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 紫外可見分光光度計(UV1800PCDS),購自上海美譜達儀器有限公司；電熱恒溫水槽(DK-80),購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；超聲波清洗器(KH5200B),購自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；電子天平(YP2001N),購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵,購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LC20A高效液相色譜儀,購自日本島津公司；BT25S電子天平(0.01 mg),購自賽利多斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；雙槽展開缸,購自瑞士卡瑪公司；硅膠HSG板,購自煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所。

1.2 試劑 乙酸乙酯、甲苯、甲酸、三氯化鋁、磷酸、乙醇、均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水,為實驗室自制。

1.3 藥物準(zhǔn)備 對照品：槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號 100081-201408,含量：99.1%),木犀草素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號：111520-201605,含量：99.6%)；芹菜素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號：111901-201603,含量：99.2%)。

楊樹花口服液樣品：委托揚中牧樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 取楊樹花口服液5 mL,用乙酸乙酯分兩次提取,每次10 mL,合并乙酸乙酯層,蒸干,殘渣加甲醇1 mL溶解,作為供試品溶液。另取芹菜素對照品、木犀草素對照品、槲皮素對照品適量,加甲醇制成每1 mL含0.1 mg溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國獸藥典》二〇一五年版二部附錄0502)試驗,吸取上述四種溶液各3 μL,分別點于同一硅膠HSG薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以2%三氯化鋁乙醇溶液,105℃加熱,取出置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果見圖1。

圖1 薄層色譜法鑒別

2.2 總黃酮測定 參照居羚和《中國藥典》(二〇一五年版一部)中“天南星”[5]方法制定楊樹花口服液中總黃酮測定方法質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：

2.2.1 對照品溶液的制備 取芹菜素對照品適量,精密稱定,加60%乙醇制成每1 mL含12.25 μg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取楊樹花口服液5 mL,置于50 mL量瓶中,用60%乙醇稀釋,并定容至刻度；從此瓶中精密吸取1 mL溶液置具塞錐形瓶中,精密加入60%乙醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)45 min,放冷,再稱定重量,用60%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL,置10 mL量瓶中,加60%乙醇至5 mL,加1%三乙胺溶液至刻度,搖勻,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可見分光光度法(《中國獸藥典》二〇一五年版二部附錄0401),在400 nm的波長處測定吸光度。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取芹菜素對照品溶液1、2、3、4、5 mL,分別置 10 mL 量瓶中,各加 60%乙醇至5 mL,加1%三乙胺溶液至刻度,搖勻,以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外 -可見分光光度法在400 nm的波長處測定吸光度。以芹菜素對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.1004X+0.01340(R2=0.999 93),結(jié)果表明,芹菜素在1.225～6.125 μg/mL與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 按2.2.2項下方法操作,測定同一供試品溶液在不同時間的吸光度。結(jié)果表明,吸光度在5～90 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5 回收率試驗 取已知總黃酮含量的供試品溶液5.0 mL于50 mL量瓶中,再加入12.25 mg/mL的芹菜素對照品溶液4 mL,按2.2.2項下方法測定,結(jié)果平均回收率為100.4%,RSD為1.66%(n=6)。

2.2.6 樣品中總黃酮的含量測定 取3批楊樹花口服液樣品按2.2.2項下方法制備供試品溶液,測定吸光度后代入2.2.3項下線性方程中計算出濃度,測定得楊樹花口服液中總黃酮以芹菜素計為10.3 mg/mL。

2.3 木犀草素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Allti-ma C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為甲醇 -0.4% 磷酸(48∶52)[6]；流速為 1.0 mL/min；進樣量為 20 μL；檢測波長為350 nm；柱溫為30℃。在上述件下進行測定楊樹花口服液樣品中木犀草素峰峰形對稱,與其他組分分離度好,理論塔板數(shù)≥6 000,結(jié)果見圖2、圖 3。

圖2 木犀草素對照品溶液色譜圖

2.3.2 溶液的制備 對照品貯備液的制備 取木犀草素對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含木犀草素164 μg的溶液,作為對照品貯備液。

精密吸取上述木犀草素貯備液2 mL于20 mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,制成每1 mL含木犀草素16.4 μg的對照品溶液。

圖3 楊樹花口服液供試品溶液色譜圖

供試樣品液的制備：精密吸取楊樹花口服液5 mL,用乙酸乙酯分兩次提取,每次10 mL,合并乙酸乙酯層,蒸干,殘渣用色譜甲醇溶解后,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶并定容,搖勻,濾過,濾液過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取木犀草素貯備溶液 0.5、1、2、2、4 mL 分別置 20、20、20、10、10 mL量瓶中,加色譜甲醇稀釋至刻度,搖勻,依次注入液相色譜儀,測定峰面積。以對照品的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=687 96X+14 642(R2=0.999 8),結(jié)果表明,木犀草素在4.1～164.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取濃度為16.4 μg/mL的木犀草素對照品溶液20 μL,重復(fù)進樣6次,分別測定峰面積,RSD為1.67%(n=6),結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密移取楊樹花口服液5 mL,按2.3.2項下方法制備供試品溶液,按2.3.1項色譜條件,分別在于0、2、4、8、12、24 h 進樣,測定木犀草素峰面積,RSD值為2.62%,結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批楊樹花口服液按2.3.2項下方法平行制備6份供試品溶液,按2.3.1項色譜條件測定,記錄木犀草素峰面積,RSD值為1.98%(n=6),結(jié)果表明該方法測定供試樣品重現(xiàn)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密移取已知含量的楊樹花口服液9份,分別精密加入濃度為32.8的μg/mL 的木犀草素對照品溶液 2.5、2.5、2.5、5、5、5、7.5、7.5、7.5 mL,按2.3.2項下方法制備供試品溶液,按2.3.1項色譜條件測定,計算回收率。見表1,結(jié)果表明本方法的準(zhǔn)確度較好。

表1 楊樹花口服液中木犀草素加樣回收率測定結(jié)果

2.3.8 樣品中木犀草素的含量測定 取3批楊樹花口服液樣品,按2.3.2項下方法制備供試品溶液,按2.3.1項色譜條件測定,記錄木犀草素峰面積,依照標(biāo)準(zhǔn)曲線中線性回歸方程計算樣品中木犀草素的含量,測定結(jié)果見表2。

表2 楊樹花口服液中木犀草素含量測定結(jié)果

3 討論

現(xiàn)有資料中關(guān)于楊樹花口服液介紹的文獻只有7篇,其中只有1篇文獻涉及楊樹花口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為采用高效液相色譜法測定楊樹花口服液中水楊苷的含量[8]；因缺少楊樹花對照藥材的研制單位,無法采購其對照藥材,故文中鑒別部分無對照藥材對照。

3.1 薄層鑒別 在薄層色譜法鑒別試驗中,考察了藥典方法中的乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(6.5∶4∶0.8∶0.8)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(10∶54∶0.5)[8]、乙酸乙酯-甲酸-水(7∶2.5∶2.5)[9]和甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶0.2)[10],最終確定本研究所用展開體系為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶4∶1)；考察了不同的類型的薄層板：硅膠H板、硅膠G板、硅膠GF254板和硅膠HSG板,結(jié)果表明,硅膠HSG板效果最好,木犀草素和槲皮素分離效果好,目標(biāo)斑點清晰。

3.2 總黃酮 總黃酮測定中樣品處理常用方法有超聲處理和加熱回流處理文獻方法[11]顯示超聲提取效果優(yōu)于加熱回流提取；另外借鑒《中國藥典》中方法中“精密量取供試品溶液5 mL,置具塞錐形瓶中,加1%三乙胺溶液至刻度,搖勻”,測試時供試品吸光度大于1,故調(diào)整取樣量為1 mL。

3.3 含量測定 木犀草素含量測定樣品提取過程中采用乙酸乙酯萃取時,分層效果不好,采用了加熱和超聲兩種方法進行處理,試驗結(jié)果表明,樣品超聲比加熱測得的木犀草素含量高。對流動相組成考察時發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸水體系[12]槲皮素和木犀草素?zé)o法分開,分離度較差,故采用甲醇-磷酸水體系。