CK18在乳腺癌血清中的表達與臨床意義

張 青 ，黃 錢，劉曉燕 ，甘 淋

（西南醫科大學：1基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，2附屬醫院乳腺外科，3醫學基礎研究中心，四川瀘州 646000）

乳腺癌是發生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，近年來其發病率呈逐年上升的趨勢并呈現年輕化，嚴重威脅著女性的身心健康[1]。乳腺癌的復發和轉移是導致其死亡的主要原因，也是臨床治療的難點和重點[2-3]。近年來，雖然對乳腺癌發生和發展的分子機制研究逐年深入，但其具體的發病機制仍然是不清楚的，同時也缺乏高效特異的腫瘤診斷標志物。尋找乳腺癌患者術后復發、遠處轉移、評估療效及預后的早期診療分子標志物，其最終目的是要降低乳腺癌人群的死亡率[4]。

細胞角蛋白（cytokeratin，CK）是細胞骨架的中間絲蛋白家族中最大、最復雜的亞類，它不僅維持上皮細胞及組織的穩定性和完整性，同時還參與了細胞內的信號轉導通路，與細胞的分裂、運動以及分化、凋亡等過程直接相關[5]。研究發現，細胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)在肺癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等表達顯著異常，并且與多種腫瘤的轉移、病情進展以及預后直接相關[6]。本研究通過對比健康人和乳腺癌患者血清中CK18的表達情況，以探討其表達異常能否在乳腺癌的篩查、診斷、腫瘤監測及預后評估等方面提供一種更好地選擇，為其治療提供新的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016年9～12月西南醫科大學附屬醫院乳腺外科乳腺癌患者外周血26例，并經病理證實；26例健康人血清來自健康體檢中心。本研究經醫院理委員會批準，且研究對象均知情，并簽署知情同意書。

納入標準：①所有研究對象均為女性，年齡、性別以及體重等病例資料完整；②患者入院采集血液時未經放療、化療或者手術治療；所有病例經病理診斷證實為乳腺癌。

排除指標：①妊娠、哺乳期患者；②乳腺癌術后病理分期、分子分型不明確者；③合并胃癌、結直腸癌等消化系統或其他惡性腫瘤的乳腺癌患者；④乳腺癌患者在采集外周血前1周內有藥物服用史；⑤健康人納入前1年內有手術治療病史或有既往腫瘤病史；⑥患者不同意加入實驗。

1.2 標本采集

病理標本均為晨起空腹時采集血液標本，于取樣30 min內置于4℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后凍存于-80℃備用。

1.3 主要的實驗試劑及儀器

CK18一抗購自Bioworld生物科技有限公司；二抗購自CST公司山羊抗兔；電泳儀、轉移電泳儀槽均購自美國Bio-Rad公司；低溫離心機購自Thermo Fisher公司；酶標儀購自BioTek公司；掃描儀購自基因有限公司

1.4 染色方法和結果判定

免疫組織化學嚴格按照Envision兩步法標準流程進行操作，按照WHO乳腺腫瘤組織學分類（2012）[7]，結合2015年St.Gallen共識[8]進行診斷。ER、PR陽性的判斷標準為：≥1%的腫瘤細胞出現細胞核陽性。HER-2為膜著色，不著色為HER-2（-）；陽性細胞數＞10%，著色弱且不連續為HER-2（1+），著色中等且部分不連續為HER-2（2+），著色強且連續為HER-2（3+）；本研究中將HER-2（-/1+/2+）判為陰性，HER-2（3+）判為陽性或過表達。

1.5 實驗方法

乳腺癌及健康人的血清標本采用蛋白質免疫印跡（western blot，WB）檢測，將血清標本于4℃過夜解凍，4℃，12 000 r/min離心60 min，去除高豐度蛋白。10%SDS-PAGE凝膠分離，上樣50μg總蛋白，PVDF膜100V轉膜1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，CK18抗體（1∶500）及GAPDH（1∶10 000）室溫2.5 h后4 ℃過夜；洗膜3次，每次10 min，加入二抗；熒光顯影，并采集蛋白條帶圖像，用ipp6軟件分析相對灰度值。

1.6 統計方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，用百分比描述病理學資料，計量資料用均數±標準差（±s），兩個樣本均數比較用t檢驗，計數資料比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 健康人和乳腺癌患者血清中CK18含量比較

采用WB檢測26例乳腺癌患者和26例健康人血清中CK18表達，結果顯示：在26例乳腺癌患者血清中，CK18陽性表達19例，陽性率73%；在健康人血清中，CK18陽性表達25例，陽性率96%（圖1）。分析CK18陽性的乳腺癌患者與健康人血清中CK18/GAPDH相對灰度值，發現：健康人組CK18/GAPDH相對灰度值為（0.11±0.06），乳腺癌患者組CK18/GAPDH相對灰度值為（0.24±0.10）（圖2）。對兩組的相對灰度值進行統計學分析，提示CK18在乳腺癌患者血清中表達增高，差異具有統計學意義（t=2.458，P=0.039）。

圖1 WB檢測CK18在血清中表達情況

2.2 臨床病理學特征比較

對CK18在乳腺癌患者血清中表達與臨床病理學特征的相關性進行比較,其中CK18陽性表達乳腺癌患者的中位發病年齡較CK18陰性表達乳腺癌患者高，分別為（46±6.30）歲和（45±12.76）歲；腫塊平均直徑在2.5 cm左右，同時伴有淋巴結轉移均在50%以上；兩者病理類型主要以浸潤性導管癌為主，為90%左右，WHO分級主要為Ⅱ級；免疫組化顯示：ER、PR、HER-2均為陽性占90%左右。結果顯示，CK18在乳腺癌患者血清中表達情況在上述各種因素中均無統計學差異，兩者之間差異均無統計學差異（P＞0.05）。

圖2 兩組血清中CK18和GAPDH相對灰度值比較

表1 乳腺癌患者血清中CK18陽性表達和CK18陰性表達臨床病理學特征比較

3 討論

目前，乳腺癌已經成為全球女性最高發的惡性腫瘤。研究發現，2018年美國乳腺癌患者發病率和死亡率較以往仍持續升高[9]。據文獻報道，在我國乳腺癌現已位居女性各類癌癥發病率之首[10]。故尋找乳腺癌早期診斷和評估預后的特異性分子標志物已成為研究熱點。細胞角蛋白18存在于上皮細胞的胞質中，參與調節細胞的重要信號轉導途徑，例如細胞周期、凋亡以及癌癥進展。目前有許多研究表明，CK18在許多腫瘤疾病中異常表達，其中包括呼吸系統、消化系統、泌尿系統及婦科等多個系統的腫瘤。CK18是肝細胞中重要的中間絲蛋白，已被確認為各種肝炎進展的潛在標志物。一項Meta分析發現，與健康人血清相比，肝炎患者血清中CK18表達水平明顯升高，可能與與肝纖維化加重，肝細胞凋亡和嚴重肝損傷有關，并且表明血清中CK18表達在檢測肝損傷方面具有重要的價值[11]。Ismail等[12]通過檢測30名肝硬化患者和30名肝癌患者血清中CK18的表達，發現肝癌患者血清中CK18表達明顯升高，并且靈敏度高于臨床常用的血清甲胎蛋白（AFP）的測定，并且CK18和AFP聯合檢測的靈敏度高達98%，CK18有望成為肝癌患者新的分子生物診斷標志物。De等[13]通過觀察179例非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者、113例肺部良性疾病患者和200例健康人的血清后發現NSCLC患者血清中CK18表達明顯高于良性組和健康組，對NSCLC的預后評估具有重要的意義。

國內外相繼報道了CK18與不同系統腫瘤之間的研究，但與乳腺癌的研究報道并不多，而且既往的研究主要集中在癌組織、癌旁組織中CK18表達情況，CK18與乳腺癌患者血清的報道甚少。Bozza等[14]發現在下調乳腺癌細胞系（T47D，BT474和MCF7）角蛋白8基因的表達，隨著K8/K18蛋白表達的缺失，DR5蛋白表達水平顯著增加，并增加了TRAIL誘導的細胞凋亡的敏感性，表明K8/K18蛋白的過表達保護乳腺癌細胞系免受TRAIL誘導的細胞凋亡。Yang等[15]評估了乳腺癌中CK18過表達與ER、PR和HER2之間的關系，發現CK18高表達與PR和HER2陽性表達顯著相關，與ER陽性表達無明顯關系，并且高表達的CK18與腫瘤大小（≥2 cm）、年齡（≥50歲）以及乳腺癌疾病的進展呈正相關。Zhang等[16]發現將人肺癌H1975和Calu-3細胞的CK18敲低后其運動和遷移能力明顯減弱且CK18高表達的患者具有更差的總生存期和無病生存期(disease-free survival，DFS）。根據一項Meta分析顯示，乳腺癌患者血清中CK18高表達與其總生存期（overall survival，OS）顯著相關，其在血清中的高表達預示著乳腺癌預后不良[15]。

4 結 論

CK18在健康人和乳腺癌患者血清中均表達，但在乳腺癌患者血清中明顯高于健康人。這與以往關于腫瘤包括乳腺癌、肝癌等的研究結論相一致，表明CK18是乳腺癌早期診斷、療效、術后監測乳腺癌復發的潛在生物標志物。另外，在乳腺癌患者血清中CK18表達與年齡、腫瘤大小、WHO分級高低、病理類型、ER、PR、HER-2表達與否均無明顯相關性。這與以往的結果不符，可能是因為本實驗屬于小樣本資料，在統計分析上可能存在偏倚，需要后期大量的基礎和臨床研究進一步證明CK18在乳腺癌血清中的表達情況及和各臨床因素的關系。