百草枯中毒患者肺部抗菌肽LL-37和細胞因子的變化

譚 丹，曾小琴，徐 偉，周人杰

（陸軍軍醫大學第二附屬醫院：1急診科，2呼吸科，重慶 400037)

百草枯（paraquat）在農業生產中廣泛應用，作為一種快速滅草劑具有較強的毒性，由于其屬于高效能接觸型除草劑，內吸作用強,時常發生百草枯中毒事件，當前尚無一種有效的治療方法[1]。百草枯中毒患者會導致嚴重的肺部損傷、纖維化[2]，且百草枯急性中毒的患者病死率，可達到80%。然而其發病機制仍不清楚。近年來，LL-37以及Th細胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17等）在肺部疾病的研究中越來越廣泛。LL-37是一種內源性抗微生物肽，具有提高免疫力的生物學功能[3]。此外，同樣具有免疫調節作用的細胞因子可在內源性或外源性刺激作用下誘導細胞產生低分子蛋白[4]。因此，本研究的目的是對百草枯中毒患者肺部LL-37和Th細胞因子的狀態進行研究。將本院急診科于2016年5月至2017年5月期間收治的10例百草枯中毒患者作為此次研究的實驗組，另招募體檢10例健康人群為對照組，觀察兩組人群Th細胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17）以及LL-37水平的變化情況。

1 資料和方法

1.1 資料

將本院急診科于2016年5月至2017年5月期間收治的10例百草枯中毒患者作為此次研究的實驗組，其中男性有3例，女性有7例，年齡范圍14～59歲，平均年齡為（34±4.45）歲，服用劑量為35～200 mL，平均服用劑量為（52±6.39）mL。收集患者服藥后48 h靜脈血10 mL并儲存在抗凝管內。所有樣本通過干冰運輸，血漿和血清樣品在20 min內1500r/min 4℃離心15 min。將LL-37分析所需的血漿樣品儲存在-70℃的聚丙烯管中。細胞因子分析所需的血清樣品儲存在-20℃。對照組為10例健康查體志愿者攝入相等劑量生理鹽水，其性別、年齡與實驗組相比，沒有顯著差異，具有可比性（P＞0.05）。此次研究涉及的20名研究者均獲得本院倫理委員會批準，每個提供血液的患者也在知情同意書簽字。

1.2 試驗方法

1.2.1 血氣分析

由本院檢驗科采用RAPIDPoint?400/405血氣分析儀（血氣分析儀編號：TG010708099）進行處理。

1.2.2 使用固相酶聯免疫吸附試驗測量LL-37的水平

根據說明書，將樣品和標準物在包被有識別抗人LL-37的小鼠單克隆抗體的微量滴定孔中37℃溫育2 h，使用R﹠D Systems提供即用型試劑盒。將與鏈霉親和素-過氧化物酶綴合的生物素化示蹤抗體用于結合人LL-37。綴合的鏈霉親和素-過氧化物酶與底物和四甲基聯苯胺反應，并且在加入草酸后停止酶反應。用分光光度計在450nm測量吸光度。通過將吸光度值獲得標準曲線，從標準曲線確定樣品中LL-37的濃度。

1.2.3 流式細胞技術檢測

使用人Th試劑盒（BMS817FF，eBioscience，Inc.，SanDiego，CA，USA）通過流式細胞術（FACSCalibur;BDBiosciences，FranklinLakes，NJ，USA）,使用 Flow-CytomixTMPro 3.0軟件進行分析。用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。首先制備全血細胞懸液，取肝素或EDTA抗凝全血(100 μmol/份)，置12×75 mm專用塑料試管中。每份加入20 μmol特異性熒光單抗，另一份加入熒光標記的無關單抗作同型對照，室溫下避光染色15 min。置Q-PREP儀上溶解紅細胞、穩定和固定白細胞，靜置5 min。之后上流式細胞儀檢測細胞因子水平。

1.2.4 動物實驗及病理切片

重慶醫科大學實驗動物中心購買清潔級成年雄性SD大鼠60只，體重180～220 g（動物使用許可證號：SYXK（渝）2016-0001）。3R原則給予人道關懷，隨機分為兩組。實驗組采用一次性灌胃方式染毒10 mg/mL的百草枯溶液，染毒容量為5 mL/kg，對照組相同劑量生理鹽水灌胃，各組動物均于染毒后6、12、18、24 h采用下腔靜脈穿刺取血約 5 mL，靜置20 min，離心后取血清，-70℃凍存,采用酶聯免疫吸附法(ELISA)待檢測,肺組織病理學的檢查:取下肺組織，置于體積分數為10%的甲醛溶液中固定，,石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡觀察。

1.3 統計學分析

實驗數據采用統計軟件SPSS 19.0分析，統計圖用GraphPad Prism進行處理，數據以均數±標準差(±s)表示，兩個樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 百草枯中毒患者的臨床表現

收集的10例百草枯中毒患者大部分以呼吸系統癥狀為主要表現，10人次中發生咽痛10例（100%）、口腔灼傷10例（100%）、惡心嘔吐9例（90%）、腹部壓痛10例（100%）、胸悶胸痛4例（40%）、呼吸困難7例（70%）、血尿9例（80%）、休克3例（30%）、頭痛3例（30%）、昏迷2例（20%）。

2.2 百草枯中毒患者動脈血氣分析變化

由表1結果可知，實驗組與對照組相比,其PO2、PCO2、pH值以及碳酸氫鹽（HCO3-）顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 百草枯中毒患者動脈血氣分析變化

2.3 百草枯中毒患者血清LL-37濃度和Th相關細胞因子水平

由圖1結果可知，與對照組（體檢10例健康人群血液樣本）相比較，實驗組百草枯中毒患者的血清Th細胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-17）以及LL-37水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 兩組百草枯中毒患者血漿LL-37濃度和Th相關細胞因子水平

2.4 兩組大鼠LL-37水平隨時間變化情況

如圖2所示：6、12、18、24 h對照組LL-37水平變化差異不具有統計學意義(P＞0.05），實驗組LL-37的水平隨時間增加，與對照組比較各時間點LL-37水平均升高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

圖2 兩組大鼠LL-37水平隨時間變化情況

2.5 實驗組大鼠不同時間點肺外觀及HE染色

染毒后6 h大體肺出現水腫，鏡下肺泡擴張稍充血（圖3A、a），12 h大體肺出現充血、水腫點灶出血，鏡下肺泡擴張充血，肺泡間隔增寬，伴有炎性滲出液及中性粒細胞、淋巴細胞的浸潤（圖3B、b）

24 h大體肺出現充血、水腫，廣泛出血，鏡下出現肺泡毛細血管的擴張充血，內皮細胞腫脹,肺泡腔內蛋白水腫液的滲出，大量中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞浸潤，肺泡間隔彌漫增寬，出現彌漫性間質纖維化樣改變（圖3C、c）。

圖3 實驗組大鼠不同時間點肺HE染色病理切片

3 討 論

目前，急性百草枯中毒常常造成患者的肺部繼發性纖維化，嚴重者可致其死亡[5]。早期的病理特征顯示有大量的炎性細胞浸潤從而造成肺實質的變性壞死，細胞外基質以及纖維結締組織增生常常出現在中毒的中、晚期，是一個病理性動態變化的過程[6-7]。之前有研究顯示，在百草枯中毒幸存的患者中，肺部輕微損傷的患者在較長時間內也表現為限制性功能損傷，最后也可能會引起不可逆的肺間質纖維化[8]，對于患者的預后也有極大的影響[9-10]。可見百草枯中毒肺部繼發性纖維化不僅決定該疾病的死亡率，還影響其預后，而肺部纖維化的發生和一系列的免疫過程密切相關，趨化免疫細胞、調節炎性促進因子/抑制因子的分泌、協調天然免疫和獲得性免疫等功能，大量研究表明LL-37通過上述過程發揮了免疫調節作用，LL-37是cathelicidin肽Hcap-18的C末端切割產物，能直接殺死細菌、真菌和病毒，其表達調節失控也能引起多種疾病。目前還有研究證實LL-37通過MAPK信號通路調控IFNγ的表達，LL-37還通過激活樹突狀細胞調節T-輔助細胞分化。Th細胞活化和分化在免疫反應中也至關重要，3種以上的Th細胞參與免疫反應，Th1細胞通過產生IFNγ調節免疫反應。Th2細胞通過產生IL-4、IL-5以及IL-13調節免疫反應，Th17細胞產生IL-17，IL-17又能反過來促進LL-37的表達，由此可見IFN-γ、IL-4、IL-17以及LL-37可能都參與到了草枯中毒肺部繼發性纖維化的免疫反應過程中，并且IFN-γ、IL-4、IL-17的變化水平似乎受LL-37的調控，具有正相關性，上述各項因子也與肺損傷的水平呈正相關，前述實驗也間接證明了這一點。

T細胞可在IL-17的刺激下激活，從而促進上皮細胞和內皮細胞產生致炎因子，如IL-4、IL-7、IL-8等[10-11]。機體在炎癥早期的損傷時能夠及時的促使中性粒細胞的分泌，從而有效的阻止組織壞死，在介導中性粒細胞參與的過程中，LL-37起到了重要作用，有效介導前炎反應[12]。此外，同時IFN-γ可誘導IL-6參與抗炎的作用。LL-37主要是中性粒細胞和上皮細胞分泌產生，具有多種活性作用[13-14]，其活性包括調節炎癥反應，趨化免疫細胞至損傷部位或感染部位，促進再上皮化及損傷修復等[15-16]。

此次研究我們發現實驗組百草枯中毒患者在48 h后會出現呼吸系統癥狀。實驗組患者與對照組人群相比，其PO2、PCO2、PH值以及碳酸氫鹽（HCO3-）顯著降低，說明百草枯中毒能夠造成患者低氧血癥、過度換氣以及代謝性酸中毒。實驗組百草枯中毒患者的血清細胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-17）以及LL-37水平顯著較高，說明細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17以及LL-37可能都參與到了草枯中毒肺損傷過程中，并且可作為百草枯中毒所致肺部損傷的早期敏感指標。然而，人體中毒是一個極其復雜的病理生理過程，與它受毒物攝入量、救治時間與方式、患者本人情況等多種因素的影響。而在后續的動物實驗中發現，隨著時間進展LL-37的水平也會逐漸升高，且與肺部損傷，炎癥反應具有相關性，LL-37在組織損傷修復中發揮重要功能。LL-37通過轉錄激活上皮細胞生長因子(EGFR)和誘導FPFL-1的表達，促進纖維細胞以及氣道上皮細胞向損傷區域的遷移，并參與增殖與修復。另外LL-37通過EGFP和MAPK/ERK調節的信號通路，調節單核吞噬系統促進了肉芽組織的形成，參與損傷修復，這可能也是肺纖維化的病理基礎

4 結論

綜上，本研究認為LL-37以及Th細胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-17）參與了百草枯中毒所致肺部損傷，且升高時間較早，具有早期檢測意義；LL-37水平可能與中毒時間以及肺損傷程度呈正比，通過早期人為干預LL-37水平能否對緩解百草枯中毒甚至是肺纖維化程度，值得進一步研究。