苗藥九仙羅漢接骨湯促進SD大鼠脛骨骨折愈合中TGF-β1動態表達

羅清龍 唐良華 熊屹 劉玉召

(1.四川省德昌縣人民醫院骨科，四川 德昌 615500；2.貴陽中醫學院第二附屬醫院骨二科，貴州 貴陽 550002；河南省開封市人民醫院骨科，河南 開封 475000)

骨折是指骨的力學完整性、連續性的丟失，繼而患者自感傷處疼痛，體查發現骨折處出現腫脹、功能障礙及局部骨擦音、異常活動等表現的一類疾病，常因外傷而引起，是最為常見的外科疾病之一。苗醫藥加速骨折愈合的動物實驗、病例研究報道較少。本實驗組運用現代基因及蛋白檢測的技術，檢測苗藥九仙羅漢接骨湯對SD大鼠脛骨骨折后TGF-β1細胞因子的動態表達，以探究其加速骨折愈合的機理。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8周齡健康SD大鼠120只，SPF級，雌雄各半，體重(220±20) g，由貴陽中醫學院動物所購買。許可編號：SCXK-(軍)2012-0011。

1.1.2實驗藥物 九仙羅漢接骨湯煎劑由仙桃草20 g、九節茶15 g、地羅漢3 g組成。九仙羅漢接骨湯的成人(70 kg)每日劑量為生藥0.54 g/kg，按人/鼠體表面積比率換算等效計量法計算后，每只每天0.68 g/mL，稀釋至0.17 g/mL。按傳統方法煎煮后無菌封瓶，4 ℃冷藏柜儲存備用。生理鹽水(均由貴陽中醫二附院提供)。

1.1.3主要試劑和儀器 SABC免疫組化試劑盒(Biomics公司)；DAB顯色試劑盒及一抗、二抗、PBS緩沖液(Boisynthesis公司)；EDTA脫鈣液(pH 7.2)、4%多聚甲醛、二甲苯、Goldview Ⅰ(美國Solarbio公司)；TriZol總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒、5x RNA Loading Buffer(TaKaRa Bio公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀、瓊脂糖凝膠電泳槽(BIORAD公司)；NanoDrop2000超微量分光光度計(德國Thermo Scientific公司)、顯微圖像分析儀(德國opten公司)。

1.2方法

1.2.1骨折模型的建立(改良鉆孔法) 大鼠采用腹內注射法麻醉(7%水合氯醛，0.5 mL/100 g)，麻醉滿意后予6%的硫化鈉左下肢脫毛備皮，清潔紗布擦拭，右側臥位放于造模臺上，自制固定模具使左小腿水平放置。碘伏棉球由左足到左大腿上段消毒3遍。無菌布巾覆蓋展露造模區四周，鉗定穩固。于脛骨結節下2 mm沿脛骨脊切長約1.5 cm縱行切口，分撥鼠外皮，繼續沿脛骨脊外側緣0.5 mm縱軸方向切開淺、深筋膜層，分撥開脛骨前肌群，展露脛骨外骨面。充分顯露術野后，小功率鉆在鼠膝關節脛骨結節下2 m處由脛骨外骨面向髓腔造孔道1，鉆頭直徑為0.3 mm，可鉆達髓腔，但不破壞內側骨外皮質，原孔道1處換1 mm鉆頭擴大孔道，在第一孔下沿脛骨縱軸方向，孔間距2 mm，依照前法造孔道2及孔道3。生理鹽水沖洗后，分層縫合切口處組織，適量紅霉素軟膏外敷傷口及周緣，麻醉清醒后分籠飼養，此后持續3 d給予8萬單位青霉素肌內注射[1]。

1.2.2分組及標本取材 所有造模成功大鼠隨機均分成接骨湯組、生理鹽水組。接骨湯組麻醉復蘇后灌予九仙羅漢接骨湯，2 mL/次，Bid，生理鹽水組灌予等量生理鹽水。常規分籠飼養。術后1、3、7、14、21、28 d分批拉頸處死，每組各10只，以造模處為中心取10 mm骨段。

1.2.3免疫組化技術檢測骨痂組織中TGF-β1表達 截取5 mm骨段，4%多聚甲醛淹沒標本，4 ℃冰箱下固定24 h，予PBS液清洗×3次，20 min/次。移至EDTA中脫鈣，量約10mL ，更替EDTA液1 W/次，持續30 d。不銹鋼針插入后未感受阻力，此情況提示脫鈣達標。2%NaOH浸泡，時間10 min，雙蒸水洗，時間10 min。依次經乙醇脫水六次，放入無水乙醇與二甲苯比例1∶1液體中20 min，轉移至純二甲苯20 min。侵蠟30 min。包埋后運用切片機以骨折端中央為中心縱行切開制成5 μm厚的蠟片，40 ℃水中展片至無皺褶，放置于60 ℃烘箱40 min，烘干切片。依次經脫蠟至水、抗原修復、染色、顯色劑顯色、復染、分化、藍化、脫水后中性樹脂封片，光鏡觀察。結果判定：蛋白水平表達與大鼠脛骨骨痂組織中出現褐黃色顆粒數及顏色深度呈正相關性。未顯褐黃色者為陰性。10×40倍光鏡下視檢采圖，所得骨組織片再在10×10倍光鏡下隨機抽取3個視野作陽性表達計數，各標本TGF-β1表達的計量指標以3個視野計數均值為準。

1.2.4q-PCR檢測骨痂細胞中TGFβ1mRNA表達量 研磨缽在180℃環境烤干1.5～2h，將從-80℃冰箱中取出已備好的骨痂組織用骨鉗夾碎后放入研磨缽中，棒研磨標本加入覆蓋骨痂組織的液氮后使用研磨成細粉，提取骨痂組織中的總RNA。所選基因引物序列由上海凱信生物科技有限公司設計合成。TGF-β1擴增片斷長度為111 bps，其上游引物序列為：5’TCAATACGTCAGA-CATTCGG3’，下游引物序列：5’TACCAAGGTAACGCCAGGA 3’。同時以擴增片段長度155 bp 的actin 作為內參照，actin上游引物序列：5’-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3’，下游引物序：5’-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3’。采用瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA完整性。NanoDrop2000超微量分光光度計進行總RNA濃度及OD260/280檢測，測定總RNA質量是否達到實驗要求。在ABI 7500 PCR器上進行操作，反應設置為：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，1 min。重復第2步，共40個循環。采用染料法(SYBR Green I)進行TGF-β1mRNA相對定量分析，用2-△△ct法分析結果。

2 結 果

2.1實驗動物分析 骨折模型的制作過程中，4只SD大鼠因麻醉不當而死亡，均予以補充。大鼠左脛骨造模術口均愈合良好，無一例感染。拉頸處死前所有大鼠均健活，且生長良好，飲食、二便、呼吸頻率、精神狀態和活動均正常，口、鼻、耳、眼均無異常分泌物，說明苗藥九仙羅漢接骨湯口服具有一定的安全性。

2.2免疫組化檢測結果分析 TGF-β1蛋白表達水平與大鼠脛骨骨痂組織中出現褐黃色顆粒數及顏色深度呈正相關性。與生理鹽水組相比，接骨湯組中TGF-β1的MOD值在骨重建14～28 d時差異顯著(P<0.01)。該結果提示在苗藥干預后14～28 d接骨湯組中的TGF-β1的平均光密度值的升高程度明顯高于生理鹽水組。接骨湯組骨折模型所取標本中骨祖細胞數量、成軟骨細胞數量、骨小梁出現的時相及重建程度均優于生理鹽水組。見表1、圖1。

表1 不同時相中TFG-β1平均光密度值

注：與生理鹽水組比較▲P<0.01。

圖1 兩組不同時相TGF-β1的免疫組化檢測( ×400)

2.3q-PCR方法檢測結果 理想的RNA純度A260/A280應在1.9～2.1范圍之間。經檢測，各組總RNA的純度及濃度符合實驗要求。骨痂組織總RNA提取結果可明顯見28S、18S條形光帶的出現，且28S條形光帶明亮度約為18S條形光帶的2倍，條帶周圍未見拖尾現象，說明接骨湯組和生理鹽水組中樣本提取的RNA具有良好的完整性，符合本實驗要求，見圖2。

圖2 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.4不同時間中TGF-β1mRNA相對表達情況 接骨湯組在造模后第1～3天TGF-β1mRNA表達量與生理鹽水組相當(P>0.05)；在7 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的1.34倍，相較有差異(P<0.05)；在14 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的1.45倍，在21 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的1.85倍，在28 d時接骨湯組表達量是生理鹽水組的2.05倍，14～28 d時相同時相比較均有顯著差異(P<0.01)。見表2。

表2 不同時間中 TGF-β1mRNA相對表達

注：與生理鹽水組比較，△P<0.05，▲P<0.01。

3 討 論

苗族醫者認為氣與血是人體的重要要素，其與人體健康密切相關，因此“氣常阻，血常瘀”是人體發病的重要原因之一。本課題組從中醫“骨折三期分治”和苗醫“通氣散血法”、“毒亂致病論”相結合下的理論指導下挖掘出民間經驗方苗藥九仙羅漢接骨湯，其具有活血化瘀、通絡止痛、接骨續筋之功效。方中藥物由仙桃草、九節茶、地羅漢組成。先現代藥理學來看，綠原酸做為仙桃草主要成分之一，其能夠明顯的加快成骨折后骨細胞增殖分化，從而加速骨折愈合[2]。方芳等[3]對仙桃草促進骨折愈合機制進行探討，通過兔骨缺損造模仙桃草干預性治療后檢測VEGF細胞因子，發現單味苗藥仙桃草可在骨重建早期提高VEGF的表達，獲得加速骨重建的效應。仙桃草內服能促進骨不連模型兔骨折端中BMP-2、VEGF表達從而使兔橈骨骨不連得到改善[4-5]。臨床研究[6]也表明仙桃草具有幫助骨折斷端重建、修復的效果。本實驗組前期[7-9]，通過苗藥九仙羅漢接骨湯干預兔脛骨干骨折動物模型，并以血Ca、血P、ALP、X線片評定骨痂生長、HE染色及VEGF免疫組化結果為指標，發現苗藥九仙羅漢接骨湯使骨痂成型加快，進而有減少骨折愈合時間的效果。

TGF-β家族都是由兩條相同肽鏈組成的多肽。研究[10-11]發現，相對于TGF-β2和TGF-β3只有在軟骨形成期才能表達，TGF-β1在骨重建啟動后表達的時間最長，且在骨組織中含量較高。組織中的TGF-β1在骨折后重建過程中，具有加快成骨母細胞有絲分裂的的生物學功能，增加骨折部位成骨細胞、成骨基質的募集，并且在整個骨重建的過程中TGF-β1都會周期性增長并參與整個骨折愈合的調節，只是在不同時期TGF-β1表達情況不同。本研究結果中，接骨湯組與生理鹽水組的TGF-β1蛋白及基因的表達均呈階梯性增長，再次驗證了TGF-β1參與整個骨折愈合過程。TGF-β1是骨重建過程中軟骨內成骨的標志性因子之一[12]。相關研究[13]發現，通過桃紅四物湯調控外源性TGF-β1，作用于骨母細胞，從而對成骨細胞的數量及活性進行調節，加快骨重建。本研究結果中，1～7 d時，接骨湯組與生理鹽水組TGF-β1平均光密度值同一時段相當。而在14～28 d時，接骨湯組14～28 d時間內MOD值顯著高于生理鹽水組。接骨湯組在造模后第1～3 d TGF-β1mRNA表達量與生理鹽水組同一時段相當；而在7～28 d時相內，接骨湯組TGF-β1mRNA表達量分別是生理鹽水組的1.34倍、1.45倍、1.85倍、2.05倍。兩組TGF-β1基因及蛋白的表達量在骨折愈合過程中隨時相的增加而階梯性增長，但生理鹽水組表達明顯低于接骨湯組。免疫組織化學檢測中，接骨湯組骨折模型所取標本中骨祖細胞數量、成軟骨細胞數量、骨小梁出現的時相及重建程度均好于生理鹽水組。

綜上，通過九仙羅漢接骨湯干預后增強TGF-β1表達從而有效的縮短了模型鼠骨重建的時間。不足之處在于，此次實驗中只是根據不同時相進行分組，未探究苗藥九仙羅漢接骨湯低、中、高濃度的最佳配比，得出最佳效果；其次，苗藥九仙羅漢接骨湯的毒副作用實驗尚未完善，均擬在下一步實驗中繼續探究。