通城虎醇提物對大鼠的腎毒性研究

韋立志 廖作莊 楊斌 凌蘭興 王柳萍

(1.廣西醫科大學第二附屬醫院，廣西 南寧 530007；2.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021；3.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200)

通城虎，別名天然草、血萎、血藤暗消，收錄于《廣西中草藥》，主要分布于廣西的陸川、昭平、蒼梧等地，具有祛風止痛，消腫解毒等多種功效[1-2]。臨床煎湯內服應用于胃脘痛，腹痛，小兒驚風，咽喉炎等；外用搗敷可用于跌打損傷，風濕骨痛，毒蛇咬傷等病癥，效果顯著，在民間得到普遍運用[3]。然而，目前國內外對通城虎研究極少，尤其對其藥效學研究和毒理學研究尚屬空白。因此，本研究對通城虎醇提物的腎毒性進行探討，為民間和臨床安全用藥提供安全性指導，從而使通城虎得到更好的使用和推廣。

1 材料與方法

1.1實驗動物 實驗動物為健康的成年SD大鼠，雌雄各半，體重(230±20)g，大鼠及基礎飼料均由廣西醫科大學實驗動物中心提供(動物合格證：SCXK桂2009-0005)。動物飼養于廣西醫科大學實驗動物中心，動物房為自然光照，溫度為20～22 ℃，相對濕度為40%～60%。給予大鼠自由進食和飲水。

1.2藥物，試劑和儀器 通城虎藥材：由廣西市場上采集得到的廣西弄崗通城虎。利福平：規格0.15 g/粒，批號121112，成都錦華藥業。水合氯醛(分析純)：上海國藥集團。NAG試劑盒：規格50T，批號20130115，購自南京建成生物工程研究所。主要儀器：電熱恒溫水浴箱(北京賽多利斯儀器有限公司)，全自動血生化分析儀(日立HITACHI，7100)，全自動血液分析儀(希森美康SYSMEX，XT-2000iv)，離心機：賽默飛世爾公司，型號：LEGENO MICRO 17R。5 mL 注射器、20 mL注射器、灌胃管、普通采血管、手術剪、刀片、開口器、手術鑷。

1.3方法

1.3.1藥品的配制 通城虎醇提物的制備：以6.5 kg通城虎生藥和50 L 95%乙醇濃縮得到232 g/190.5 mL提取物(每1 g提取物相當于生藥28.02 g)，即1.22 g/mL的提取物樣品(每1 mL相當于生藥34.12 g)。通城虎提取物溶液的配制：(1)按每只大鼠體重240 g，通城虎提取物每天劑量為260 mg/(kg·d)，高劑量的配制為：稱取12.48 g通城虎提取液，裝入研缽中，倒入10 mL吐溫80，研磨混勻，加入20 mL純水混勻，轉入量筒，加純水至400 mL。中、低劑量按此法各配制400 mL通城虎提取物溶液。10%水合氯醛溶液：5.0 g水合氯醛加入50 mL生理鹽水(NS)中，攪拌均勻，配成10%溶液，現配現用。大鼠使用劑量為0.3 mL/100 g。

1.3.2分組及大鼠單腎切除手術 將SD大鼠隨機分為五組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。除空白對照組以外，對其余各組大鼠進行右腎切除手術：大鼠在實驗室適應3 d后，按體重用10%水合氯醛進行麻醉，將其置于手術臺，在大鼠右側腹部切開2 cm長的切口，暴露右側腎臟，結扎腎門，將大鼠右腎摘除，逐層分別縫合腹壁肌肉和皮膚，在手術切口處給予利福平膠囊粉末進行殺菌處理。大鼠清醒后將其放回鼠籠，自由進食和飲水。每天對大鼠的活動狀態和進食量進行觀察記錄。

1.3.3給藥方法 術后術后第5天開始灌胃給藥，給藥前各組大鼠稱量體重，高、中、低劑量組的給藥劑量分別為通城虎醇提物260、130、65 mg/(kg·d)(相當于通城虎推薦的最高日用量的8倍、4倍和2倍)，空白組對照組和模型對照組給予相同體積的蒸餾水，1次/d，連續給藥14 d。在給藥期間觀察動物的毛發、活動、精神、糞便、分泌物等情況，試驗前后稱量大鼠體重，并隨體重變化調整給藥量。

1.4實驗數據測定 于末次給藥前1 d分別將每只大鼠放入代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h尿液，離心取上清液，測定尿量，測定尿NAG酶。末次給藥2 h后將大鼠麻醉，取材前禁食禁水，無菌環境下，將大鼠固定于手術臺上進行腹主動脈取血。取部分全血檢測紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)。其他全血經分離血清后用全自動生化分析儀測定血清尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)含量。處死大鼠并進行系統解剖，肉眼觀察主要臟器組織有無異常的病理改變，胸、腹腔等體腔有無異常積液。稱量心、肝、脾、肺、腎、等器官的濕重，按體重折算臟器系數(臟器重g/100 g體重)。將肝臟、腎臟組織固定，做HE 染色處理后進行組織形態學觀察。.

2 結 果

2.1大鼠的一般情況 空白對照組大鼠正常攝食、飲水，生長良好，活動良好，無死亡情況。模型對照組大鼠造模后第5天，可見毛色恢復光澤，進食量歲偶有減少，但精神狀態良好，活動正常。給藥組得大鼠在給藥第3天后開始出現毛發凌亂，顏色發黃干枯，食欲差等反應，高劑量組尤為明顯；給藥7 d后，可見給藥組的部分大鼠活動減少，精神狀態不佳，高劑量組的個別雌性大鼠出現明顯消瘦。給藥14 d后，高劑量組大鼠的2只大鼠死亡。

2.2大鼠的體重變化 與空白對照組和模型對照組比較，大鼠在右腎切除的條件下，給予通城虎醇提物后，低劑量組在給藥5 d后體重增長速度均明顯減慢，而高劑量組和中劑量組大鼠體重可見減輕趨勢；14 d后給藥組大鼠體重均比對照組減輕(P<0.05)。模型對照組與空白對照組對比無明顯差異(P>0.05)。結果表明，通城虎醇提物可減輕右腎切除大鼠的體重。結果見圖1。

圖1 大鼠的體重變化曲線

2.3大鼠臟器系數的測定 不考慮體重變化前提下，與空白對照組比較，給藥組大鼠被連續灌胃給藥14 d，大鼠的腎臟臟器系數明顯增加(P<0.01)；高劑量組與模型對照組比較，腎臟臟器系數明顯增加(P<0.01)；各給藥組大鼠的心、肝、脾、肺臟器系數與空白對照組比較無明顯差異(P>0.05)。模型對照組與空白對照組比較，腎臟臟器系數也增大(P<0.01)。結果見表1。但是在本實驗中，由于給藥各組大鼠的體重是減輕的，因此給藥組大鼠臟器系數增大在對照組和藥物試驗組之間出現的顯著性差異的原因有可能是給藥組動物體重明顯下降所造成的，不能作為評價證據。

表1 通城虎提取物對大鼠臟器系數的影響

注：與空白組大鼠相比較，**P<0.01。與模型對照組比較，ΔΔP<0.01。

2.4大鼠尿液指標的測定 與空白對照組比較，給藥組大鼠的尿液指標NAG酶均高于空白對照組(P<0.05)，且隨劑量的升高呈上升趨勢。模型對照組NAG酶也略有升高，但與空白對照組比較無明顯差異。各組大鼠尿量無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 通城虎提取物灌胃給藥對大鼠尿量及尿NAG酶的影響

注：與空白組大鼠相比較，*P<0.05。

2.5大鼠腎功能血清生化指標的測定 與空白對照組比較，高劑量組大鼠血液中的BUN 、CREA 、UA指標均有明顯升高(P<0.01)；中劑量組CREA、UA指標明顯升高(P<0.05)，BUN差異無統計學意義；低劑量組CREA明顯升高(P<0.05)，BUN、UA略有升高但差異無統計學意義。模型對照組與空白對照組比較無明顯差異。見表3。

表3 通城虎提取物灌胃給藥對大鼠腎功能指標的影響

注：與空白組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01;中、低劑量組與高劑量組比較：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

2.6通城虎提取物對大鼠肝臟組織的影響 給藥14 d后，對照組與給藥組各組大鼠肝臟組織的肝索、肝竇、匯管區、肝小葉等結構均正常。見圖2。

注：A.空白對照組；B.高劑量組；C.中劑量組；D.低劑量組。

圖2肝臟組織變化(HE，20×)

2.7通城虎提取物對大鼠腎臟組織的影響 給藥14 d后，高劑量組大鼠中出現小管水變性，部分區域片狀小管溶解性壞死，殘留小管有管型形成，但炎癥反應并不明顯，小球及血管未見明顯病變。可見高劑量組的腎毒性已經形成，而中、低劑量組腎臟出現了不同程度的腎小管水變性，中劑量出現管形。見圖3。

注：A.空白對照組；B.高劑量組；C.中劑量組；D.低劑量組。

圖3腎臟組織變化(HE，20×)

3 討 論

隨著中藥及中藥制劑使用范圍的擴大，中藥相關的不良反應報道也日益增加，其中以“馬兜鈴酸(AA)腎病”最為引人注目[4-5]。馬兜鈴酸腎病(AAN)，又稱關木通中毒性腎病，特指服用含馬兜鈴酸成分的中藥如關木通、馬兜鈴、廣防己、細辛、天仙藤、青木香等而導致的急性或慢性腎小管間質疾病[6]。AA的發病機制推測如下：(1)內質網應激反應機制；(2)氧化應激機制；(3)損傷物質聚積[7-8]。過量攝入馬兜鈴酸是導致AA的主要原因。通城虎來源于馬兜鈴科馬兜鈴屬植物通城虎，含有馬兜鈴酸類化合物、木脂素、生物堿和有機酸等成分[9-11]，其中含馬兜鈴酸A，7-羥基馬兜鈴酸A 及木蘭花堿馬兜鈴總酸性成分含量為0.60%，這些成分均可引起AAN，導致機體出現進行性腎間質纖維化，甚至可致癌致突變[12]，

本研究發現，給藥8 d后，與空白組比較，發現各給藥組大鼠的體重增長明顯減慢(P<0.05)，其中高劑量給藥組對體重影響較大，導致該組大鼠給藥前后體重明顯減輕(P<0.05)，空白組與模型組對比無明顯差異。NAG是溶酶體酶之一，在腎臟近曲腎小管中含量最豐富，而溶酶體是各種攻擊因子(如自由基、生物毒素、化學毒素等)容易侵犯的靶位，當近曲腎小管損傷時會迅速誘導溶酶體酶釋放，尿中NAG酶顯著增高，且較其他尿酶增高更早，因此尿NAG酶是反應腎小管損傷的敏感指標[13]。本研究發現，通城虎給藥14 d后，高、中劑量組NAG酶明顯升高(P<0.05)，低劑量組有一定升高但無統計學意義，表明大鼠腎臟受損，高劑量通城虎給藥具有腎臟毒性。通城虎給藥14 d，對尿量的影響，并未出現急性馬兜鈴酸腎病如少尿或非少尿性急性腎功能衰竭表現，推測是因為通城虎的給藥劑量較小，而導致急性馬兜鈴酸腎病的主要原因是短期內大量服用含馬兜鈴酸的中草藥。進一步對大鼠的肝臟和腎臟組織病理學改變進行觀察，發現通城虎對大鼠的肝臟無明顯影響，而一定劑量的通城虎提取物給藥后可造成大鼠腎臟不同程度的損傷。綜上結果，通城虎提取物連續給藥14 d，即可造成大鼠明顯的腎功能損害，表現為：體重降低，尿肌酐、血肌酐、血尿素氮、尿NAG酶升高，腎臟組織病理學改變。

在本試驗中大鼠的給藥計量分別為260、130、65 mg/(kg·d)，分別相當于生藥7.29 g/(kg·d)、3.64 g/(kg·d)、1.82 g/(kg·d)。按生藥藥理試驗動物與人體之間的等效劑量換算[14]，大鼠換算為成人的劑量是1∶0.162，即：按成人體重為60 kg，高劑量1 d用量為70.9 g。而通城虎推薦的最高日用量為9 g[3]，因此，高劑量差不多是推薦劑量的8倍，中劑量和低劑量則分別是4倍、2倍。但低劑量仍出現NAG酶及血清CREA升高的腎損傷指標。而且由于不同地域的通城虎毒性成分含量可能不同，因此在臨床使用時一定要防止藥物過量，做到個體化給藥，若是存在腎臟疾病或腎功能障礙，則應該禁止使用；在用藥過程中密切關注毒性反應，有條件的應該監測腎小管功能。