湖北省利川市育齡婦女亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性分布研究

許敏 江鴻 牟丹 牟耀華 藍(lán)巧

[摘要]目的 比較湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院土家族和漢族育齡婦女亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C667T、A1298C基因位點(diǎn)及甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）A66G基因位點(diǎn)多態(tài)性分布的情況，研究其位點(diǎn)的群體遺傳性特征。方法 以2015年1月～2017年12月在湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院建卡的681例漢族和553例土家族孕期女性作為研究對(duì)象，采集口腔黏膜上皮細(xì)胞提取DNA樣本，采用Taqman-MGB技術(shù)進(jìn)行MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)分析基因多態(tài)性的分布特征與已報(bào)道其他地區(qū)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果 湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院土家族女性的MTHFR C677T位點(diǎn)的等位基因頻率與延邊朝鮮族、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;MTHFR A1298C位點(diǎn)的等位基因頻率與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTRR A66G位點(diǎn)的等位基因頻率與烏蘇哈薩克族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。利川土家族MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在完全連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.508）。利川市漢族MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在完全連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.424）。結(jié)論 湖北省恩施州利川市土家族和漢族MTHFR和MTRR的基因多態(tài)性分布差異性并不顯著，但其地區(qū)婦女的上述基因分布具有區(qū)域特異性，不同于其他地區(qū)。

[關(guān)鍵詞]葉酸;亞甲基四氫葉酸還原酶;甲硫氨酸合成酶還原酶;基因多態(tài)性分布

[中圖分類號(hào)] R737.33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）3（a）-0192-05

葉酸作為人體所必需的B族維生素，參與人體眾多重要物質(zhì)的合成和代謝。葉酸的缺乏可以導(dǎo)致基因組DNA鏈的斷裂、染色體的不穩(wěn)定及尿嘧啶的錯(cuò)配等，進(jìn)而破壞了DNA的合成和修復(fù)，影響核酸、組蛋白甲基化修飾的改變[1]。葉酸代謝酶亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）的基因多態(tài)性是影響唇裂、唐氏綜合征等疾病發(fā)病的重要因素[2-3]。葉酸代謝基因與某些臨床不良事件存在一定的相關(guān)性，如不良妊娠事件（復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、低體重患兒、早產(chǎn)兒和出生缺陷等）、癌癥（胃癌、大腸癌和宮頸癌等）、心血管疾病和精神疾病等。

研究表明，MTHFR C677T和MTRR A66G位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致葉酸水平下降，從而導(dǎo)致嬰兒發(fā)生神經(jīng)管畸形和其他出生缺陷的高危因素[4-5]。此外，MTHFRA1298C雖未被證實(shí)和出生缺陷的發(fā)生存在必要關(guān)系，但其基因多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平具有顯著相關(guān)性[6]，而Hcy水平偏高是影響神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、唇腭裂等出生缺陷的危險(xiǎn)因素之一[7]。

本研究的目的在于探討湖北省恩施利川市漢族婦女人群MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G位點(diǎn)多態(tài)性分布情況，獲得本地區(qū)的群體遺傳特征，同時(shí)將本文數(shù)據(jù)與其他地區(qū)少數(shù)民族人口進(jìn)行對(duì)比，為不同地域的人群預(yù)防出生缺陷制定具有針對(duì)性的干預(yù)措施提供有效的科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究經(jīng)湖北省恩施州利川市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，排除非本地區(qū)戶籍及DNA抽提不合要求的樣本，選取2015年1月～2017年12月在湖北省利川市人民醫(yī)院建卡及做孕期保健的553例土家族和681例漢族女性作為研究對(duì)象。在受檢者知曉本研究情況并簽署知情同意書(shū)后，通過(guò)提取口腔黏膜細(xì)胞中的DNA，進(jìn)行基因檢測(cè)，評(píng)估其葉酸利用能力。

1.2方法

1.2.1儀器及試劑

MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR基因A66G位點(diǎn)的SNP分型采用Taqman-MGB技術(shù)測(cè)定。

1.2.1.1儀器? 低溫離心機(jī)Beckman J-6BABI、7900型熒光定量PCR儀，相關(guān)儀器均使用美國(guó)Applied Biosystems（AB）公司產(chǎn)品。

1.2.1.2試劑? Buffer A、Buffer B、飽和酚、氯化鈉及異丙醇等，相關(guān)試劑均使用美國(guó)AB公司產(chǎn)品。

1.2.2樣本DNA的采集

由經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的人員進(jìn)行樣本采集工作。使用專用的口腔黏膜上皮細(xì)胞采集器進(jìn)行操作，提取受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞，具體方法為：在口腔內(nèi)一側(cè)上下刮拭40次以上，力量以略微鼓起為宜，然后利用柱式抽提試劑盒抽提樣本的DNA。

1.2.3基因檢測(cè)

MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR A66G基因位點(diǎn)的SNP分型采用Taqman-MGB技術(shù)測(cè)定，相關(guān)儀器、試劑均使用美國(guó)AB公司產(chǎn)品。

1.2.4熒光定量PCR檢測(cè)

對(duì)3個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)所用探針信息如表1所示。

每個(gè)反應(yīng)體系的總體積為10 μl，包含濃度為20 ng/μl的DNA模板1 μl，2×Taqman Universal Master Mix 5 μl，20×Taqman-MGB探針0.5 μl，去離子水3.5 μl。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱10 min，隨后在92℃下15 s，60℃ 1 min的條件下進(jìn)行20個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，再接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（80℃ 15 s，60℃ 90 s）。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用分析軟件確定各個(gè)樣品的基因分型結(jié)果。

1.3觀察指標(biāo)

樣本MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR基因A66G位點(diǎn)基因多態(tài)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用HaploView 4.2軟件進(jìn)行SNPs的Hardy-Weinberg平衡及連鎖不平衡水平（LD）分析。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

本研究Hardy-Weinberg平衡校驗(yàn)?zāi)康氖球?yàn)證樣本的可靠性。結(jié)果表明，收集到的湖北省恩施利川市土家族和漢族人群的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性分布情況符合遺傳平衡（P>0.05），數(shù)據(jù)來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w，樣本具有區(qū)域代表性。

2.2各民族育齡婦女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)基因型構(gòu)成的比較

本研究采用思南苗族[8]、延邊朝鮮族[9]、南寧壯族[10]、烏蘇哈薩克族[11]、銀川回族[12]、新疆維吾爾族[13]數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，研究結(jié)果提示，湖北省恩施州利川土家族和漢族婦女之間各位點(diǎn)的基因型構(gòu)成比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。利川土家族婦女MTHFR C677T位點(diǎn)的基因型構(gòu)成與延邊朝鮮、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTHFR A1298C位點(diǎn)的基因型構(gòu)成與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTRR A66G位點(diǎn)的基因型構(gòu)成與烏蘇哈薩克族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3各民族育齡婦女MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)等位基因頻率的比較

湖北省恩施州利川土家族和漢族婦女之間各位點(diǎn)的等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。利川土家族婦女MTHFR C677T位點(diǎn)的等位基因分布與延邊朝鮮、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTHFR A1298C位點(diǎn)的等位基因頻率與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;利川土家族婦女MTRR A66G位點(diǎn)的等位基因頻率與烏蘇哈薩克族、銀川回族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

2.4 MTHFR C677T和MTHFR A1298C位點(diǎn)組合情況

湖北省恩施州利川市土家族婦女MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)出現(xiàn)了6種組合情況，最常見(jiàn)的三種組合依次為：CT/AA 35.5%、CC/AC 19.3%、CC/AA 17.9%（表4）。單倍型分析表明，存在三種組合：CA（65.9%），TC（20.8%），TA（13.3%）。MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在較大程度的連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.508）。漢族婦女MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)出現(xiàn)了6種組合情況，最常見(jiàn)的三種組合依次為：CT/AA 32.5%、CT/AC 24.9%、CC/AC 18.4%（表4）。單倍型分析表明，存在三種組合：CA（63.1%），TC（19.8%），TA（17.0%）。MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)存在連鎖不平衡現(xiàn)象（D′=1.0，r2=0.424）。

3討論

葉酸是一種重要的人體必需營(yíng)養(yǎng)素，是水溶性B族維生素家族中的一員。1941年，美國(guó)科學(xué)家米切爾在菠菜中發(fā)現(xiàn)葉酸[14]。葉酸分為天然葉酸和合成葉酸兩種。天然葉酸廣泛存在于動(dòng)植物食品中，在酵母、肝臟以及蔬菜中含量尤為豐富。由于食物中的葉酸易被光照、加熱等環(huán)境因素影響，因此日常膳食中的葉酸在人體內(nèi)生物利用度較低。與之相比，合成葉酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，故廣泛應(yīng)用于圍生期婦女等需要長(zhǎng)期補(bǔ)充葉酸的人群[15]。

自2000年中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)首次將葉酸列入膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量以來(lái)，我國(guó)居民的葉酸攝入量得到明顯改善。一項(xiàng)中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)狀況調(diào)查研究中顯示[16]，中國(guó)3～12歲兒童葉酸水平為7.62 mg/L，總?cè)狈β蕿?.52%。健康成年人的葉酸水平檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果提示，葉酸缺乏率隨年齡增長(zhǎng)呈“兩邊高，中間低”的趨勢(shì)，這可能與兒童與老年人葉酸吸收代謝功能差有關(guān)。研究結(jié)果還表明[17]，男性血清葉酸缺乏率明顯高于女性，這可能與男性吸煙和飲酒史等因素相關(guān)。根據(jù)我國(guó)35～64歲人群血液葉酸狀況較大樣本調(diào)查結(jié)果顯示，南方夏秋季節(jié)紅細(xì)胞葉酸與冬春季節(jié)相比顯著下降，北方則顯著升高[18]。由此可見(jiàn)，葉酸補(bǔ)充劑量的制定應(yīng)該綜合考慮到人群、地區(qū)等多方面差異。

本研究結(jié)果提示，湖北恩施利川市土家族和漢族婦女的葉酸代謝遺傳多態(tài)性分布和其他民族漢族婦女存在差異。湖北省恩施州利川市利川土家族和漢族婦女之間各基因分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。湖北省恩施州利川市土家族MTHFR 677TT純合突變基因型頻率為10.8%，低于利川漢族（13.7%）、思南苗族（12.9%）、延邊朝鮮（18.8%）、新疆維吾爾族（10.9%），高于南寧壯族（5.1%）、烏蘇哈薩克族（5.0%）、銀川回族（6.5%），與延邊朝鮮族、南寧壯族、烏蘇哈薩克族、銀川回族比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;MTHFR A1298C位點(diǎn)基因型分布與南寧壯族、烏蘇哈薩克族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而MTRR A66G位點(diǎn)的基因型分布與烏蘇哈薩克族、新疆維吾爾族婦女比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)對(duì)比，MTHFR、MTRR的基因多態(tài)性分布受到民族影響，具有一定的民族特異性。

綜上所述，本文通過(guò)開(kāi)展對(duì)湖北省恩施利川市土家族和漢族MTHFR和MTRR基因多態(tài)性和地區(qū)分布特征的研究，了解湖北省恩施利川市不同民族和不同地區(qū)的葉酸代謝相關(guān)基因的多態(tài)性分布。為我國(guó)制定個(gè)性化的葉酸補(bǔ)充方案和各項(xiàng)婦幼保健政策的制定提供有力的理論支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Novakovic P，Stempak JM，Sohn KJ，et al.Effects of folate deficiency on gene expression in the apoptosis and cancer pathways in colon cancer cells[J].Carcinogenesis，2006，27（5）：916-924.

[2]Shaw GM，Rozen R，F(xiàn)innell RH，et al.Infant C677T mutation in MTHFR，maternal periconceptional vitamin use，and cleft lip[J].Am J Med Genet，1998，80（3）：196.

[3]Brandalize AP，Bandinelli E，Borba JB，et al.Polymorphisms in genes MTHFR，MTR and MTRR are not risk factors for cleft lip/palate in South Brazil[J].Braz J Med Biol Res，2007，40（6）：787.

[4]方玉蓮，馬世坤，石鷗燕，等.MTHFR基因C677T多態(tài)性與神經(jīng)管缺陷相關(guān)性的Meta分析[J].天津醫(yī)藥，2015，43（5）：552-558.

[5]張炳珍，代炳芹，張興亮，等.母親甲硫氨酸合成酶A2756G及其還原酶A66G基因多態(tài)性與子代神經(jīng)管缺陷易感性關(guān)系的Meta分析[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，50（7）：125-132.

[6]陳雪，郝勝菊，張翰儒，等.孕期婦女MTHFR、MTRR基因多態(tài)性與同型半胱氨酸水平的關(guān)系[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（7）：23-26.

[7]吳瑕，柳國(guó)勝，萬(wàn)波，等.孕母血漿同型半胱氨酸水平與胎兒出生缺陷的關(guān)系及其臨床意義[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26（14）：1104-1107.

[8]毛萬(wàn)成，魯衍強(qiáng)，薛琰，等.貴州思南縣漢族與苗族、土家族女性MTHFR、MTRR基因多態(tài)性研究[J].中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2015，23（5）：310-313.

[9]于延輝，魯衍強(qiáng)，李瑛，等.延邊朝鮮族自治州漢族女性和朝鮮族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分布研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（S5）：7-9.

[10]蔣武，魯衍強(qiáng)，李瑛，等.南寧市壯族和漢族女性MTHFR和MTRR基因單核苷酸多態(tài)性比較[J].廣西醫(yī)學(xué)，2014， 36（11）：1517-1519.

[11]孫玉萍，魯衍強(qiáng)，付敏，等.烏蘇市哈薩克族與回族女性5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶、甲硫氨酸合成酶還原酶單核苷酸多態(tài)性的分布特征調(diào)查[J].中國(guó)婦幼保健，2017， 32（6）：1273-1276.

[12]楊玉清，唐菊香，魯衍強(qiáng)，等.銀川市回族和漢族女性MTHFR和MTRR基因單核苷酸多態(tài)性分析[J].中國(guó)婦幼保健，2015，30（35）：6267-6269.

[13]郝友瑛，趙紅，魯衍強(qiáng)，等.新疆維吾爾族和漢族女性MTHFR和MTRR基因單核苷酸多態(tài)性比較[J].中國(guó)婦幼保健，2014，29（21）：3495-3497.

[14]Mitchell HK，Snell EE，Williams RJ.Journal of the American Chemical Society，Vol.63，1941：The concentration of "folic acid" by Herschel K.Mitchell，Esmond E.Snell，and Roger J.Williams[J].Nutr Rev，1988，46（9）：324.

[15]Keating E，Correiabranco A，Meireles M，et al.Excess perigestational folic acid exposure induces metabolic dysfunction in post-natal life[J].J Endocrinol，2015，224（3）：245-259.

[16]楊曉光，翟鳳英，樸建華，等.中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)狀況調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，11（1）：5-7.

[17]洪志軍，王承芳.514例健康成人血清葉酸及維生素B12水平測(cè)定與分析[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2015，37（5）：512-514.

[18]郝玲.我國(guó)部分地區(qū)成年人血漿葉酸的地區(qū)和季節(jié)差異比較[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002，36（5）：308-310.

（收稿日期：2018-10-11? 本文編輯：孟慶卿）