蛋黃主要蛋白質研究進展

謝云霄，耿放，王金秋*

農業部雜糧加工重點實驗室，成都大學藥學與生物工程學院（成都 610106）

蛋黃蛋白質因其優良的營養特性、多樣的功能特性和生物活性，一直是食品蛋白質研究的重要對象。蛋黃中的蛋白質主要包括卵黃免疫球蛋白（Immunoglobulin Y，IgY）、蛋黃低密度脂蛋白（Egg yolk low density lipoprotein，EY-LDL）、蛋黃高密度脂蛋白（Egg yolk high density lipoprotein，EY-HDL）以及卵黃高磷蛋白（Phosvitin，Pv）等。就蛋黃主要蛋白質的研究進展進行綜述，為蛋黃蛋白質的深入研究和功能性高值化新型蛋制品的開發提供參考。

1 蛋黃蛋白質的合成與轉運

與蛋清蛋白質主要在輸卵管中合成不同，蛋黃蛋白質的前體主要由母雞的肝臟合成并分泌到血液中，通過血液循環達到卵巢、轉移到卵母細胞中，再經過酶解和重新組合，形成蛋黃中的卵黃顆粒（Yolk granule）和漿質（Yolk plasma）。

1.1 載脂蛋白（Apolipoprotein B）與蛋黃低密度脂蛋白

雞蛋黃低密度脂蛋白（EY-LDL）存在于卵黃漿質中，約占蛋黃干重的65%。EY-LDL是一種脂蛋白復合體，其脂質部分約占90%，主要為甘油三脂和膽固醇，其由母雞血液中的極低密度脂蛋白（VLDL）轉化而來。VLDL在母雞的肝臟中合成，隨血液運輸通過卵母細胞膜上的受體介導和吞噬進入卵母細胞（蛋黃）。研究表明，EY-LDL的蛋白質部分的前體主要為載脂蛋白B（Apolipoprotein B，APOB）[1]。APOB由4 631個氨基酸組成，其翻譯后被裂解為7個片段（Apovitellenin 1～7），這些蛋白質片段與磷脂、甘油三脂和膽固醇組合，共同構成了EY-LDL。

1.2 卵黃蛋白原（Vitellogenins）與蛋黃高密度脂蛋白和卵黃高磷蛋白

蛋黃高密度脂蛋白（EY-HDL）含量約占蛋黃蛋白質的16%，卵黃高磷蛋白的含量約占蛋黃蛋白質的4%，它們都來源于卵黃蛋白原（Vitellogenins）。卵黃蛋白原在母雞肝臟中合成并分泌到血液中，經血液循環轉運到卵巢后，在受體介導下通過內吞作用進入卵母細胞。轉運到蛋黃中的卵黃蛋白原主要有三種，Vitellogenin 1～3，它們序列差異較大，但具有相同的結構域。隨后，卵黃蛋白原發生裂解，產生Lipovitellin-1、Lipovitellin-2、卵黃高磷蛋白和卵黃糖蛋白（Yolk glycoproteins，YGPs）[2]。其中，Lipovitellin-1、Lipovitellin-2與磷脂結合，組裝成為EY-HDL復合體，而YGPs則進入到卵黃漿質部分。EY-HDL與卵黃高磷蛋白、少量的EY-LDL進一步組裝形成卵黃顆粒。

1.3 卵黃免疫球蛋白

卵黃免疫球蛋白（IgY）主要存在于卵黃漿質中，約占蛋黃總蛋白質的10%。IgY是由母雞血清中的免疫球蛋白在特異性受體介導下從血液轉移到卵母細胞中。在胚胎發育過程中，蛋黃中的IgY再次由受體介導轉移到胚胎血液中，為胚胎發育提供被動免疫[3-4]。

2 蛋黃蛋白質在蛋黃中的組織狀態

在天然條件下，蛋黃由連續的水相（卵黃漿質）和大小在0.3～2 μm范圍內的不溶性顆粒組成[5]，而EY-LDL以膠體顆粒的形式（17～60 nm）分散在卵黃漿質中。卵黃顆粒的組成為：70%的EY-HDL、10%的Pv和12%的EY-LDL。EY-HDL是一個類似球狀的假分子結構，通過磷酸鈣橋與Pv相結合，形成復雜的卵黃顆粒結構，其間含有嵌入式的EY-LDL囊泡。有研究發現，卵黃顆粒中摻入的EY-LDL是電荷和空間位阻作用的結果，其可使卵黃顆粒整體結構更為緊密和平滑，降低整體空間阻力[6]。卵黃漿質部分的組成為：約85%的EY-LDL和15%的球狀蛋白，主要為血清蛋白（Serum Albumin，又被稱為α-livetin）、IgY（γ-livetin）和卵黃糖蛋白（YGP42/YGP40/YGP30等，亦被稱為β-livetin）[7]。

3 雞蛋黃蛋白質的結構與功能

3.1 IgY的結構與功能

IgY由4個亞基組成，包括兩條重鏈和兩條輕鏈。重鏈包含1個可變域和4個恒定域，輕鏈由1個可變域和1個恒定域組成。由質譜分析得出IgY的分子質量為167 250 Da，其中重鏈的分子質量為65 105 Da，輕鏈的分子質量為18 660 Da。IgY可分為2個抗原結合片段（Fab）和1個可結晶片段（Fc），其中Fc部分是大多數生物功能作用的位點[8]。

用抗原刺激產蛋母雞的免疫系統，即可表達和分泌特異性的抗體，并轉移至蛋黃中，從而獲得特異性IgY。特異性IgY與病原體結合，可阻滯病原體的繁殖、加速病原體的清除，因此在免疫治療方面具有廣闊的應用前景。在畜禽養殖中，特異性IgY可抵御病原微生物的侵染、繁殖，起到預防和治療流行性疾病、促進畜禽幼仔生長發育、增強免疫力的作用[9]。喂食了特異性IgY的雛雞，其對球蟲病的抵抗力顯著增強，且減少了盲腸損傷和卵囊脫落，同時增強了雛雞體重[10]。在仔豬飼養中，特異性的抗病毒IgY（豬傳染胃腸炎病毒與豬流行性腹瀉病毒）具有很好的應用效果，能夠快速抑制病毒的復制，并顯著降低仔豬病死率[8]。特異性IgY亦可用于人類病原傳染病的防治，如抗輪狀病毒IgY用于治療小兒輪狀病毒腸炎，可加快病毒清除、改善臨床體征并縮短病程[11]。

此外，IgY具有很強的特異性和靈敏度，因此在免疫檢測和診斷上得到了廣泛的應用。利用免疫母雞制備抗血吸蟲蟲卵特異性IgY，并將其作為捕捉抗體用于ELISA檢測，可有效檢出人尿液中的血吸蟲可溶性蟲卵抗原[12]。王云蕓等[13]研究建立了基于特異性IgY的ELISA檢測體系，對引起腹瀉的諾如病毒進行檢測，結果顯示出良好的特異性。基于特異性IgY建立的食品中慶大霉素ic-ELISA檢測方法，其對慶大霉素具有很好的檢出效果，該方法具有推廣到其他抗生素殘留檢測的潛力[14]。

3.2 EY-LDL的結構與功能

研究表明，EY-LDL為球形納米顆粒（17～60 nm），磷脂、蛋白質和少量膽固醇形成外層膜狀結構，包圍著由甘油三酯和膽固醇組成的脂質核心。在外層膜結構中，磷脂和蛋白質提供兩親特性，對EYLDL的結構穩定性起著重要作用，而外層膜中鑲嵌的少量膽固醇分子，則增加了磷脂的剛性[7]。采用原子顯微鏡觀察EY-LDL，發現在溶液體系中，EY-LDL的濃度較低時，LDL呈單個分子的分散狀態，其尺寸一般在50～80 nm之間；且隨著濃度的增加，EY-LDL開始聚集，形成聚合物，成像尺寸增大[15]。

新鮮蛋黃是由約50%的水、30%～35%的脂質和15%～18%蛋白質組成的穩定乳液體系。EY-LDL分子自身的水包油型乳化納米顆粒結構，被認為是蛋黃乳液體系保持穩定的重要原因[16]。EY-LDL在油水界面吸附時，會發生破裂，釋放出中性脂質、磷脂、載脂蛋白，中性脂質聚集形成油滴，而磷脂、載脂蛋白則吸附在界面上，形成較為穩定的界面膜[7]。而在氣液界面上，EY-LDL破裂后，其中性脂質、載脂蛋白和磷脂組分均參與形成界面膜[17]。EY-LDL穩定的乳化納米分子結構，是構建新型食品納米乳化體系的絕佳參考模型，需要更為深入和系統的研究。

除了乳化穩定特性，EY-LDL還具有良好的凝膠特性，對蛋黃及其制品的加工和產品的質構特性具有重要影響[18]。研究顯示，EY-LDL水溶液（4%）在70℃時開始發生變性，并在75 ℃下形成熱凝膠。在加熱過程中，EY-LDL分子中的蛋白質部分發生變性解和去折疊，內部官能團暴露并通過疏水作用、交聯作用等發生重排，從而形成凝膠[7]。此外，EY-LDL在冷凍時亦會發生凝膠化，利用該特性，將其應用于動物精液（公牛、公羊、馬）的冷凍保存，可顯著提高精子的存活率和人工受精的成功率，對家畜的繁育具有重要作用[18]。

3.3 EY-HDL的結構與功能

EY-HDL是一個分子量約400 kDa的球狀分子，其蛋白質部分由4個亞基組成，分別為2個Lipovitellin-1（約125 kDa）和2個Lipovitellin-2（約25 kDa）；脂質占總分子量的25%左右，以磷脂為主。EY-HDL的蛋白質部分通過折疊，形成一個疏水性的漏斗形空腔，磷脂分子先與空腔表面的疏水性氨基酸吸附，而后甘油三酯再吸附于磷脂分子形成的新的疏水空腔中[19-20]。

在雞胚發育過程中，EY-HDL不僅分解自身為胚胎發育提供營養物質，還可以轉運微量元素和脂質，從而促進胚胎的生長。研究顯示，EY-HDL參與鋅離子的轉運，從而降低雞胚發育過程中的畸變[21]。EYHDL對腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌以及大腸桿菌均有一定的抑制作用，可以抵御病菌入侵保護胚胎[22]。與血清HDL功能相似，EY-HDL也可清除血管內壁沉積的膽固醇，具有潛在的預防動脈粥樣硬化的作用[2]。此外，EY-HDL水解后產生的多肽具有一定的抗氧化活性，是食品源功能性多肽的潛在來源[23]。

3.4 Pv的結構與功能

Pv是已知蛋白質中磷酸化程度最高的蛋白之一，在其217個氨基酸殘基中，絲氨酸（Ser）殘基為123個，占比高達56.7%，并且絕大部分絲氨酸都發生了磷酸化修飾。高度磷酸化的Pv分子整體呈無規則卷曲的線狀結構，在其N-末端和C-末端為小的疏水區域，連續的磷酸化絲氨酸片段分布于分子中部，形成了兩端疏水、中間親水的兩親性結構[24]。

由于高度的磷酸化修飾，Pv在水溶液中為典型的酸性蛋白質，易與各種陽離子（如Fe3+、Fe2+、Ca2+、Mg2+等）相結合，如蛋黃中95%的鐵離子都是以與Pv結合的形式存在的。由于鐵離子是微生物生長必須元素，亦是氧化反應的重要催化劑，因此與鐵離子的高結合力，使Pv具有一定的抑菌作用和抗氧化活性。此外，Pv與鈣離子相互作用形成的磷酸鈣橋，是Pv與EY-HDL結合形成卵黃顆粒的最為重要的作用力。

兩端疏水、中間親水的分子結構，使Pv具有良好的乳化性，其分子內大量的磷酸根提供高負電荷和靜電斥力，維持了油水界面的穩定性，抑制了乳化液的絮凝和聚集。常見的食品添加劑（如甘油、果膠、海藻糖等）可適當增加Pv的疏水性，共同使用時具有協同增效作用。同時Pv糖基化作用，可提高Pv的乳化穩定性和對極端pH環境的抗性，Pv疏水末端脂肪酸（FA）的引入是改善Pv加工特性的另一種有效手段[25]。此外，金屬離子對Pv的乳化特性具有一定影響，在乳化液形成之前添加鐵離子，Pv的乳化性能變弱，但抗絮凝的能力變強[26]。熱處理對Pv的乳化性具有負面的影響，當熱處理溫度高于65 ℃時，其乳化能力開始下降，而高于70 ℃時，乳化穩定性也開始下降[27]。

Pv水解后產生的磷酸肽（PPPs），具有多種生物活性。PPPs中的磷酸化絲氨酸殘基能夠與鈣離子結合形成可溶性絡合物，從而抑制鈣離子形成不溶性的鹽，避免鈣的流失并促進腸內鈣的吸收[28]。徐彩娜等[29]研究表明，PPPs具有清除DPPH自由基、抗氧化能力，可降低細胞的氧化應激反應。

4 雞蛋黃蛋白質的分離純化

在蛋黃蛋白質的分離純化過程中，一般先將蛋黃稀釋后離心，分別獲得卵黃漿質（上層溶液）和卵黃顆粒（下層沉淀）部分。為了達到較好的分離效果，該步驟中蛋黃的稀釋倍數通常為1～5倍，同時可添加適當濃度的鹽（＜0.3 mol/L），以提高分離效率。

4.1 卵黃漿質蛋白質的分離純化

IgY為水溶性蛋黃蛋白質，溶解于卵黃漿質中，因此，在分離獲得卵黃漿質部分后，需將其與EYLDL分開。目前常用的方法為硫酸銨沉淀法或者多聚物沉淀法，操作簡單、條件溫和，對IgY的活性影響較小。在此過程中，聚乙二醇或高分子多糖等多聚物的使用，可以促進EY-LDL的沉淀與析出，從而提高分離效率[30]。經過分離獲得的IgY純度一般可達到81%，如需進一步純化，可采用陰離子交換層析法，最終可使IgY的純度達到95%以上[30]。

在獲得卵黃漿質之后，若以EY-LDL為目標蛋白，則可通過硫酸銨沉淀法或聚乙二醇沉淀法對漿質中的EY-LDL進行進一步分離。Wang等[31]對比了上述兩種方法，結果顯示，用硫酸銨沉淀法分離提取EYLDL時，硫酸銨飽和度為30%時的效果最佳，EY-LDL的得率較高且雜蛋白含量少；聚乙二醇沉淀法中，在PEG分子量為4 000、濃度為5%、卵黃漿質溶液的pH為6的條件下，分離效果最佳。兩種方法對比，PEG沉淀法提取得到的粗提LDL干物質含油率和蛋白質提取率分別為68.14 g/100 g干物質和69.91%，硫酸銨沉淀法得到的粗提LDL干物質含油率和蛋白質提取率分別為57.72 g/100 g干物質和69.41%，前者效果要優于后者。若需要獲得更高純度的EY-LDL，可基于EYLDL分子量較大的特點，通過凝膠過濾層析法進一步除去雜蛋白。

4.2 卵黃顆粒蛋白的分離純化

卵黃顆粒中的主要蛋白質為EY-HDL和Pv，這兩種蛋白質通過磷酸鈣橋緊密結合，若要分別獲得EYHDL和Pv，首先需對卵黃顆粒進行處理，打開磷酸鈣橋。目前常用較高的離子強度打開磷酸鈣橋，如Zhang等[32]將卵黃顆粒與9倍質量的高鹽溶液（100 g/L氯化鈉）混合，攪拌使卵黃顆粒解聚，隨后向溶液中加入4%的聚乙二醇并調整溶液pH為4.5，此時在聚乙二醇作用下，EY-HDL聚集發生沉淀。從而與Pv分開。如需進一步的純化，可采用陰離子交換層析等方法[24]。

5 結語與展望

當前，對于蛋黃蛋白質的結構、功能和特性已經有了較為豐富和深入的研究，為蛋黃蛋白質的應用提供了基礎。但是，蛋黃及蛋黃蛋白質仍有諸多未知領域，如蛋黃蛋白質的翻譯后修飾結構、EY-LDL分子及卵黃顆粒超分子的組裝機制、蛋黃自身（水、脂質、蛋白質多相體系）的穩定機制等。未來，針對這些科學問題的深入探索，將進一步加深對蛋黃蛋白質的認識，促進蛋黃及蛋黃蛋白質的開發和應用。