兒童感染碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌耐藥性及耐藥基因型分析

曹靜平，景春梅

[重慶醫科大學附屬兒童醫院檢驗科/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心(重慶)/兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地 400014]

鮑曼不動桿菌(Acinetobacten baumannii，Ab)是一種非發酵的革蘭陰性桿菌，廣泛分布于水、土壤、人體皮膚及醫院環境[1]，常引起菌血癥、肺炎、腦膜炎、尿道感染、皮膚和傷口感染[2]。隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，出現了碳青酶烯類耐藥鮑曼不動桿菌(CRAb)，給臨床抗感染治療帶來了較大的困難，對醫院感染的控制提出了新的要求。已經證明耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌主要是產D類碳青霉烯酶[3]，由 blaOXA-51-like,blaOXA-23-like,blaOXA-24-like,andblaOXA-58-like基因編碼。

1 材料與方法

1.1菌株來源 1 324株鮑曼不動桿菌收集自重慶醫科大學附屬兒童醫院，其中重癥醫學科(ICU)57株，新生兒病房60株，燒傷整形病房13株，呼吸病房10株，共分離非重復的CRAb 155株，其中來自痰液標本136株，分泌物14株，膿液3株，灌洗液1株，導管1株。所有菌株均使用BD Phoenix自動微生物系統進行鑒定。以大腸埃希菌ATCC25922及銅綠假單胞菌ATCC27853作為質控菌。

1.2儀器與試劑 哥倫比亞血平板購自重慶龐通公司，藥敏紙片購自法國BioMerienx公司，Taq酶、PCR試劑購自大連寶生生物公司，PTC-100型聚合酶鏈反應(PCR)儀購自美國MJ-Research公司，TG16W微量高速離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司，THZ-C恒溫振蕩器購自江蘇太倉市實驗設備廠，DYY-2C型電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3藥物敏感性測試 用K-B法進行藥敏試驗，藥敏結果按“美國臨床試驗標準化委員會標準”判讀。

1.4模板DNA的制備 采用水煮法：取保存的鮑曼不動桿菌接種至哥倫比亞血平板培養過夜，接種環挑取數個菌落于200 μL，煮沸10 min，14 000 r/min離心10 min，用于PCR的模板DNA的終濃度為50～100 ng/μL。

1.5PCR擴增碳青霉烯酶基因 根據GenBank數據庫已收錄的碳青霉烯酶基因序列信息，設計擴增OXA-23基因，OXA-24基因，OXA-51基因，OXA-58基因，VIM2基因、SIM1基因，blaOXA-23-like、blaOXA-24-like上游ISAba1啟動元件引物序列，引物由上海生工公司合成。PCR反應條件參考文獻[4-5]進行。PCR反應體系為12.5 μL，包括10×緩沖液，0.75 μL MgCl2，1 μL dNTP，0.25 μL引物，1.25 U Taq酶以及1 μL DNA模板,其余為雙蒸水。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s。退火溫度55 ℃持續45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1．5%的瓊脂凝膠電泳5 V/cm共50 min，用溴乙錠染色后在紫外線下成像。引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物

1.6PCR產物的基因測序 對OXA-23基因，OXA-51基因，OXA-58基因，ISAba1基因的PCR純化產物送華大基因公司直接進行基因測序，所測序列與GenBank上已收錄的基因序列進行比對以確定其基因型。

2 結 果

2.1菌株臨床資料 1 324株鮑曼不動桿菌檢出碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌155株(11.71%)，其中ICU 57株，新生兒病房60株，燒傷整形病房13株，呼吸病房10株，共分離非重復的CRAb 155株，其中來自痰液標本136株，分泌物14株，膿液3株，灌洗液1株，導管1株。感染CRAb患兒年齡分布情況：28 d以內(新生兒)46株，28 d到1歲72株，1～2歲10株，2歲以上27株，見表2。

2.2CRAb耐藥情況 所有菌株除對多黏菌素敏感性最高，對阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星、四環素(TE )、復方新諾明 (SXT)、氨芐西林/舒巴坦保持一定敏感性外，對其他耐藥率均已達100%。CRAb耐藥情況見表3。

表2 155株碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌科室分布情況(株)

表3 155株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌藥敏結果[n(%)]

表4 122株碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌基因型分布情況(株)

2.3測序結果分析 隨機選取電泳結果陽性的菌株，PCR產物測序，測序結果見圖1。

2.4電泳結果 見圖2。

2.5碳青霉烯酶及金屬酶的檢測 B類碳青霉烯酶基因VIM2、SIM1；D類碳青霉烯酶基因blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51、blaOXA-58；擴增blaOXA-23-like、blaOXA-51-like上游ISAba1啟動元件檢出結果，見表4。

A：blaOXA-23-like基因；B:blaOXA-51-like基因;C:blaOXA-58-like基因；D:ISAba1基因

圖1測序結果

A：blaOXA-23-like基因；B:blaOXA-51-like基因;C:blaOXA-58-like基因；D:ISAba1基因

圖2電泳結果

3 討 論

從1985年被發現至今，CRAb的數量在世界范圍內迅速增長，這表明鮑曼不動桿菌具有對選擇性環境壓力作出快速反應的能力[6]。本研究對155株兒童分離CRAb的藥物敏感測試結果顯示：與文獻報道的成人醫院分離的CRAb不同[7-12]，兒童分離菌株對阿米卡星、環丙沙星以及左氧氟沙星保持較高的敏感率，并且與國內其他省市兒童醫院分離的CRAb不同[13]。本地區兒童分離菌株對四環素、復方新諾明及氨芐西林/舒巴坦保持較高的敏感率，這可能與兒童及成人選藥類型的不同而造成的藥物選擇壓力不同有關。不過，與成人分離菌株一致的是，這些菌株對慶大霉素、氨曲南、β-內酰胺酶類抗生素的敏感率均較低。鮑曼不動桿菌抵抗環境改變的主要方式是上調內源性耐藥機制及獲得外源性耐藥基因[7]。盡管鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類的耐藥機制與外膜蛋白的改變，外排泵的作用及青霉素結合蛋白親和力的改變等非β-內酰胺酶類機制也有關，但大量研究表明，碳青霉烯酶的產生是導致鮑曼不動桿菌對此類抗生素耐藥最主要的機制[6]。OXA酶是鮑曼不動桿菌中最早被發現的碳青霉烯酶，它為質粒或染色體所編碼，是引起全球范圍內鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥的主要酶類。國內目前浙江、北京、廣州、重慶等地區報道的CRAb產碳青霉烯酶類型均為OXA-23酶。本研究發現：與國內其他地區報道的結果相似，OXA-23酶也是重慶地區鮑曼不動桿菌中最常見的碳青霉烯酶基因型，122株CRAB中，78.69%的細菌均產生OXA-23型碳青霉烯酶，除此之外，OXA-51、OXA-58檢出率分別為65.57%、9.8%，并且OXA23/OXA51類基因占57.38%、OXA-23/OXA-51/OXA-58占4.92%。在全球范圍內，意大利首先于2006年6月報道在CRAb中發現產OXA-58型鮑曼不動桿菌[14]。同年11月比利時報道發現18株產OXA-58型鮑曼不動桿菌[15]，2011年廣州市發現1株OXA-58型鮑曼不動桿菌，因此本地區產OXA-58型CRAb的比例明顯高于國內其他地區。本研究在122株耐藥菌株中未檢出OXA-24、VIM2、SIM1碳青霉烯酶基因，擴增出OXA-51型碳青霉烯酶65.57%，在blaOXA-23-like、blaOXA-24-like上游連接有ISAba1啟動元件(88.50%)，OXA-51-like基因天然存在于鮑曼不動桿菌染色體上。TURTON等[16]報道，OXA-51-like酶顯示較弱碳青霉烯類水解活性，但是如果其上游存在ISAba1插入序列，該序列可為OXA-51-like提供啟動子，促進其大量合成，導致細菌對碳青霉烯類耐藥。

綜上所述，本院兒童分離CRAb對阿米卡星、環丙沙星及左氟沙星的敏感率顯著高于成人,并且對四環素、復方新諾明及氨芐西林/舒巴坦較國內其他省市兒童醫院保持一定的敏感率。本地區流行的CRAb產OXA-23、OXA-51、OXA-58型碳青霉烯酶，且以OXA23/OXA51類基因為主，在blaOXA-23-like、blaOXA-51-like上游連接有ISAba1啟動元件。SAba1啟動元件介導的OXA-23/OXA-51耐藥基因的水平傳播是導致本地區鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥性傳播的主要途徑。