化瘀消異膠囊對子宮內膜細胞增殖的影響

王 瀟，夏瑤賓*

（1.內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特 010021；2.內蒙古自治區中醫藥研究所，內蒙古 呼和浩特 010020）

引 言

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS，以下簡稱內異癥)是一種復雜的疾病，其發病機制不清，病變廣泛、形態多樣，極具侵襲性和復發性，嚴重影響婦女的健康和生活質量[1-2]。由于雌激素是子宮內膜異位癥病變發展的主要驅動因素，大多數已建立的治療方法都是以產生一種能暫時緩解的低雌激素狀態為目標[3]。目前，大多數用于治療內異癥的西藥效果尚可，但具有停藥后易復發，且副作用多等弊端。因此，尋求多靶位、多環節抑制異位內膜形成的藥物顯得尤為重要。

氣虛是中醫解釋內異癥發生和發展的立足點。因此，中醫臨床治療內異癥以活血化瘀為基本，另外輔以益氣、溫腎和清熱等法，整體療效較好[4]。化瘀消異膠囊（HYXYJN）98年以來用于臨床，治療子宮內膜異位癥，對子宮內膜異位癥有明顯的療效。本研究分離子宮內膜異位癥的離體細胞為模型，研究HYXYJN對子宮內膜細胞增長的影響，探討其對內異癥的影響機理。

1 主要試劑和儀器

胎牛血清，胰蛋白酶，膠原酶Ⅰ、DNAase，雄烯二酮，多聚甲醛，細胞培養板，Triton X-100，鼠抗人波形蛋白（vimentin）抗體，鼠抗人角蛋白（cytokeratin）抗體，FITC標記羊抗小鼠IgG，CCK-8試劑盒，羊抗鼠IRG/PITC；流式細胞儀(BECHMAN)、倒置相差顯微鏡(ZEISS Observer.A1)、二氧化碳培養箱(Thermo HERACELL 150i)、多功能微孔板讀數儀(Thermo VARIOSKAN FLASH)。

2 病例入選標準

2015年5月～2017年12月期間，收集內蒙古自治區人民醫院婦科就診為子宮內膜異位癥患者樣本，入選標準為：⑴年齡24～48歲；⑵月經規律，周期28～32天；⑶無其它內分泌、免疫或代謝性疾病；⑷手術前三個月內未接受激素治療。另外，用無菌方法通過刮宮或直接剪切留取子宮內膜收集5例子宮肌瘤患者樣本作為對照，其子宮內膜正常同時排除了內異癥。非內異癥組10例成活4例，內異癥組8例成活5例。

3 實驗方法

3.1 子宮內膜細胞分離培養

將清洗干凈的組織剪碎至糊狀，依次加入0.2%膠原酶Ⅰ和20 U/mL的DNA酶進行孵育。然后使用15%胎牛血清的培養液終止消化，以1000 rPm轉速離心5 min后，棄上清。重復兩次。加入含有15%血清的培養液吹打均勻，接種至培養皿，37℃、5%CO2培養箱中培養。

3.2 細胞免疫熒光染色

室溫下，經過多聚甲醛固定，TritonX-100通透和BSA封閉后，按照1:300比例滴加一抗，4eC過夜孵育。次日，棄液體，PBS清洗三次，加入FITC標記羊抗小鼠IgG(1:300)，避光孵育1 h后，DAPI復染5 min，清洗制片。PBS代替一抗孵育細胞作為陰性對照，共聚焦顯微鏡觀察vimentin和cytokeratin的表達情況。

3.3 檢測細胞生長曲線

將原代培養的內異癥和對照組內膜細胞分別進行消化，以4h103個/孔的密度接種于96孔培養板。培養24 h后，棄去培養液，加入不含血清培養液同步化24 h。分別加入不含有和含有180 μg/ml、18 μg/ml、1.8 μg/ml HYXYJN的培養液200 μl，同時各孔分別加入1h10-7mol/L雄烯二酮進行刺激。0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，檢測450 nm處測定OD值。以無細胞的培養液作為空白調整本底，以時間為橫軸，光密度值為縱軸，繪制細胞生長曲線。

4 實驗結果

4.1 子宮內膜細胞培養

酶消化后，懸浮細胞呈圓形，折光性強。置于37℃、5%CO2培養箱中培養6小時后開始貼壁。密度均勻。培養4天后，細胞融合度為85%以上，生長良好。

4.2 子宮內膜腺上皮及間質細胞免疫熒光鑒定

以PBS作為一抗進行孵育為陰性對照，角蛋白和波形蛋白染色均為陽性，表明原代培養細胞中同時含有上皮細胞和間質細胞。結果見圖1。另外，角蛋白熒光染色強度較波形蛋白染色強度弱，表明間質細胞數量較多，上皮細胞含量較少。分離培養的子宮內膜細胞中大多是間質細胞。

圖1 免疫熒光鑒定子宮內膜細胞

4.3 HYXYJN對子宮內膜細胞生長的影響

細胞生長結果見圖2所示。各組內異癥在位內膜細胞隨HYXYJN濃度增加，抑制作用加強。其中，180 μg/ml濃度的HYXYJN培養組抑制作用最強；18 μg/ml和1.8 μg/ml 濃度的HYXYJN培養組僅在96 h時有差異，其余時間點無差異。相同時間下，內異癥內膜細胞數量顯著高于非內異癥內膜細胞（P＜0.05），表明內異癥內膜細胞的增殖速度大于非內異癥內膜細胞。

5 討 論

綜上結果表明，內異癥在位內膜細胞的增殖活性明顯高于非內異癥內膜細胞；平臺期時的細胞數量也明顯高于非內異癥內膜細胞。這可能與非內異癥內膜細胞間的接觸抑制效應較強有關，細胞趨于靜止狀態。然而，內異癥在位內膜細胞間接觸抑制較弱。因此，其生長較為活躍，具有向腫瘤細胞過渡的趨勢，體現出不同于正常內膜的“惡性”行為。整體上，HYXYJN對非內異癥和內異癥在位內膜細胞的增殖活性沒有顯著影響，僅在濃度180μg/ml作用72h、96h后對細胞的增殖活力有一定抑制作用，HYXYJN組與桂枝茯膠囊組無顯著差異。

圖2 HYXYJN對分離培養的子宮內膜細胞生長的影響