MG-132對TRAIL誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡的影響

馮殿鵬 劉廣慧 韓卿

[摘要]目的 探討MG-132對TRAIL誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡的影響。方法 骨肉瘤細胞U-2 OS置于含10%小牛血清的1640培養液中，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，分為單用TRAIL組、單用MG-132組、聯合組。在應用上述三種給藥方案24 h后，分別對誘導MG-132細胞凋亡狀況進行檢測;計算細胞抑制率;光鏡下觀察細胞變化。結果 單用TRAIL組誘導凋亡效果并不理想，隨著TRAIL濃度的升高，骨腫瘤U-2 OS凋亡率不斷升高，單用MG-132組細胞隨著給藥的濃度增加，凋亡率也隨之增高，差異有統計學意義（P<0.05）;聯合組、單用TRAIL組和單用MG-132組分別與空白對照組比較，骨肉瘤細胞凋亡率均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），且單用MG-132組高于單用TRAIL組，差異有統計學意義（P<0.05），聯合組骨肉瘤細胞凋亡率明顯高于單用TRAIL組和單用MG-132組，差異有統計學意義（P<0.05）。隨著時間的推移，細胞抑制率上升，而聯合組的抑制率明顯高于TRAIL組和MG-132組，在72 h處達到最大值[（82.32±2.54）%]，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 單用TRAIL可誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡，但效果不太理想。聯合MG-132使用后，可大大提高TRAIL誘導U-2 OS凋亡的效果。

[關鍵詞]蛋白酶體通路;TRAIL;骨肉瘤;凋亡

[中圖分類號] R738.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）2（b）-0012-05

MG-132是蛋白酶體的阻斷試劑，阻斷后可使之失去活性[1]。泛肽-蛋白酶體（ubiquitin proteasome）是廣泛存在于真核細胞中，其能快速處理和降解蛋白質的非溶酶體物質，蛋白酶體是指有蛋白降解作用的酶復合體。MG132是一種肽醛，可以有效地阻斷蛋白酶體的蛋白水解活性，包含芐酯基-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸序列[2]。據報道，蛋白酶體的抑制劑（包括MG132）可以通過形成活性氧（ROS）從而誘導細胞凋亡。蛋白酶體抑制劑引起的ROS的形成和谷胱甘肽（GSH）的耗竭可導致線粒體功能障礙和隨后細胞色素C的釋放，從而導致細胞活力的喪失[3-4]。在細胞質中蛋白酶體亞群是與內質網（ER）表面、細胞骨架[5]、中心體相伴隨。大多數細胞內蛋白質，包括調節細胞周期的多種蛋白均有此通路降解[6]。

TRAIL（TNF related apoptosis inducing ligand）基因最早由Wiley等[7]在1995 年從人心肌cDNA 文庫中克隆得到并命名，1996 年Pitti等[8]克隆到同樣的基因，并命名Apo22L。由于其氨基酸序列具有TNF超家族的結構特征，并能誘導Jurkat細胞和EB病毒轉化的人類B淋巴細胞凋亡，故命名為TNF相關的凋亡誘導配體。但是有研究發現，某些腫瘤細胞對TRAIL誘導的凋亡作用并不理想，這限制了TRAIL在抗腫瘤治療中的應用[9]。本實驗基于TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡，探討蛋白酶體通路等因素對于其治療效果的影響。

1資料與方法

1.1 一般資料

MG-132購自Cell Signaling公司;新西蘭新生牛血清購自Sigma-Aldrich公司;胰蛋白酶、四氮唑藍（MTT）及雙抗購自Sigma-Aldrich公司;Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自Ambion 公司;骨肉瘤細胞U-2 OS購自上海信然公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及藥物干預方案? 骨肉瘤細胞U-2 OS置于含10%小牛血清的1640培養液中，在37℃、5% CO2飽和度的培養箱中培養。待細胞進入對數生長期時，以1×105/ml濃度接種于培養板中，培養24 h后給藥。單用TRAIL組選用400、600、800、1000 μg/L 4種濃度;單用MG-132組選用5、10、15、20 μmol/L 4種濃度，聯合應用組選用800 μg/L TRAIL以及15 μmol/L MG-132合用。在應用上述3種給藥方案24 h后，分別對誘導MG-63細胞凋亡狀況進行檢測。

1.2.2 Annexin V/PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡率? 實驗組給予400、600、800、1000 μg/L TRAIL，5、10、15、20 μmol/L MG-132以及聯合組，并設立空白對照組，24 h進行檢測。用配備好的洗滌液洗細胞3次，重懸細胞至1 ×106/ml，取100 μl 細胞（105cells）至5 ml管內，加入5 μl 培養液混勻，室溫下避光培養20 min，每管加入400 μl 1×Binding Buffer，1 h內上流式細胞儀檢測。

1.2.3 MTT法測定細胞的生長抑制效應? 將1×106/ml細胞接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁后加入不同濃度藥物細胞培養基，每孔100 μl，每種濃度平行5孔，培養24 h后，每孔加入10 μl新配制的10 mg/ml的MTT，37℃繼續孵育分別于0、24、48、72 h，棄上清加150 μl DMSO溶解，混勻后在540 nm波長測定吸光度。 腫瘤細胞抑制率（%）= （1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.3 觀察指標

于0、24、48、72 h在顯微鏡下觀察細胞形態變化及細胞抑制率。

1.4統計學方法

數據采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 光鏡下觀察細胞形態

光鏡下可見單純應用TRAIL及MG-132 分別作用于骨肉瘤細胞U-2 OS后，隨時間推移，細胞形態出現相應變化，24 h后腫瘤細胞開始變小，48 h部分腫瘤細胞進一步變小并脫落，72 h后大多數腫瘤細胞脫落并聚集成團塊。TRAIL和MG-132聯合作用時，上述現象更明顯（圖1）。

2.2 流式細胞儀結果

2.2.1 單用TRAIL組流式細胞儀結果? 單用400、600、800、1000 μg/L TRAIL的細胞凋亡率分別為（5.7±1.0）%、（6.4±2.3）%、（7.1±2.5）%、（8.6±2.1）%，結果顯示，隨著給藥濃度的增加，凋亡率也隨之增高，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.2.2 單用MG-132組流式細胞儀結果? 單用5、10、15、20 μmol/L的MG-132細胞凋亡率分別為（6.9±1.5）%、（7.8±1.3）%、（8.5±2.1）%、（9.2±1.3）%，結果顯示，隨著給藥的濃度，凋亡率也隨之增高，差異有統計學意義（P<0.05）（圖3）。

2.2.3 聯合組流式細胞儀結果? 空白對照組、單用800 μg/L TRAIL組、單用15 μmol/L MG-132組及聯合組的細胞凋亡率分別為（2.8±0.6）%、（7.1±2.5）%、（8.5±2.1）%、（9.8±1.2）%，不同用藥濃度，凋亡率也隨之變化，差異有統計學意義（P<0.05）（圖4）。

流式細胞儀結果的比較

聯合組、單用TRAIL組和單用MG-132組分別與空白對照組比較，骨肉瘤細胞凋亡率均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），且單用MG-132組高于單用TRAIL組，差異有統計學意義（P<0.05），聯合組骨肉瘤細胞凋亡率明顯高于單用TRAIL組和單用MG-132組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3 MTT測得抑制率結果

隨著時間的推移，細胞抑制率上升，而聯合組的抑制率明顯高于單用TRAIL組和MG-132組，在72 h處達到最大值[（82.32±2.54）%]，差異有統計學意義（P<0.05）（圖5）。

3討論

生物治療作為繼傳統腫瘤治療手段后的又一種治療方法，在腫瘤治療中越來越顯示出其特殊性及優越性[10-11]。特別是對骨惡性腫瘤的治療，已有大量的基礎研究報告。TRAIL是1995年克隆的TNF超家族新成員，與其受體（TNF related apoptosis inducing ligand receptor，TRA ILR）相結合后能啟動細胞內的調節細胞凋亡的信號轉導，誘導細胞凋亡，但對部分腫瘤細胞的作用不敏感[12-14]。

MG-132是泛素-蛋白酶體的阻斷劑，能有效阻斷多種調節蛋白的降解，在誘導細胞凋亡過程中起到重要作用。有研究認為蛋白質的泛肽化與包括細胞凋亡在內的許多細胞活動過程有關[15-17]。

近來有研究發現，泛肽-蛋白酶體通路可能參與了多種凋亡調節蛋白和轉錄因子的降解，在細胞凋亡的調控中起著非常重要的作用。Soldalenkov等[18]發現，當泛肽-蛋白酶體阻斷后會引起某些細胞出現凋亡。推測：在TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡過程中存在某些調節蛋白，可大大提高TRAIL誘導凋亡的作用，而這些調節蛋白很大可能是由蛋白酶體通路所降解，阻斷凋亡的傳單，增加腫瘤細胞對TRAIL的抵抗性。泛肽-蛋白酶體阻斷后，可在很大程度上保證這些調節蛋白的存在，大大提高TRAIL的誘導腫瘤細胞凋亡的作用。本研究著重探討泛素-蛋白酶體與TRAIL誘導的細胞凋亡之間的相互關系。單一使用TRAIL誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡效果較差，聯合MG-132后抑制效果顯著提高，差異有統計學意義（P<0.05），顯示出一定的臨床應用價值。目前臨床上治療腫瘤的傳統方法是手術、放療、化療相結合的方法，但對正常細胞有極大的殺傷作用，限制了其治療效果。TRAIL以其高效低毒的生物學特點，給腫瘤治療帶來了新的希望[19-20]。其內在機制并未被完全闡釋清晰，仍需進一步深入探討。

綜上所述，TRAIL可誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡，但效果不太理想。混合使用MG-132后，可大大提高TRAIL誘導U-2 OS凋亡的效果。

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（收稿日期：2018-09-19? 本文編輯：許俊琴）