高血壓大鼠腦白質病變中髓鞘和軸索改變☆

邱寶山 蔡穎 廖夢詩 林晶 范玉華○☆

腦白質病變是腦小血管病的一種重要類型，臨床表現無特異性，通常表現為認知障礙、癡呆及自主神經功能紊亂等，臨床診斷主要依據影像學上T2WI及FLAIR像側腦室旁及深部白質高信號[1-4]。腦白質病變的發病機制尚不明確，可能與血腦屏障破壞、氧化應激、內皮細胞-周細胞功能失調、腦血流自動調節等因素有關，目前臨床無有效治療方法[5-8]。有髓神經纖維由軸索和髓鞘組成，為研究軸索微結構，軸索又可分為郎飛結、結側區、近結側區和結間區4個區域，接觸蛋白相關蛋白（contactin-associated protein,Caspr）是結側區軸膜的特異性蛋白，正常的軸索微結構是有髓神經纖維跳躍式傳導的基礎[9]。目前腦白質病變典型病理改變是髓鞘缺失[10]，但對于白質纖維軸索微結構病理改變的研究甚少，為此，我們通過建立易卒中型腎血管性高血壓大鼠-雙側頸總動脈夾閉模型（stroke-prone renovascular hypertensive rats-2 vessel occlusion,RHRSP-2VO），觀察腦白質病變中軸索微結構的變化，為臨床診斷與治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組18只4周齡健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（廣東省實驗動物中心），體質量約70 g～90 g。所有大鼠均飼養于中山大學北校區實驗動物中心（SPF級環境），隨機分為假手術組（n=9）和手術組（n=9），實驗過程全部遵循科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2易卒中型高血壓大鼠慢性全腦低灌注模型的建立 手術組按照雙腎雙夾術構建RHRSP動物模型[10]，3個月后取收縮壓≥180 mmHg的大鼠按照頸總動脈夾閉的方法行右側頸總動脈夾閉術，24 h后以同樣方法行左側頸總動脈夾閉術。假手術組僅暴露雙側腎動脈和雙側頸總動脈，其余操作與手術組一致。

1.3 Morris水迷宮實驗雙側頸總動脈夾閉后12周進行Morris水迷宮實驗，實驗流程參照既往研究中的步驟進行[11]，實驗前1 d讓大鼠在池中自行游泳180 s以適應水溫和環境，第1～5天為定位航行試驗（III象限中間放置平臺，大鼠按4個象限入水點順序放入水池，每只大鼠入水順序相同，入水開始至登入平臺為逃避潛伏期，如果60 s未找到平臺則引導其登上平臺，此時記錄為（60 S），以每天4個入水點的逃逸潛伏期均數記錄為每天的逃逸潛伏期；第6天為空間搜索試驗，撤掉平臺，記錄60 s穿越平臺次數。

1.4腦組織取材與病理學水迷宮實驗結束后，對所有大鼠行灌注取腦；用4%多聚甲醛經心臟灌注后取出大腦，于4%多聚甲醛浸泡24 h，于嗅球后方1.5 mm處取4 mm厚腦組織，包埋后制成冠狀面連續石蠟切片（3 μm）。 Hematoxylin-eosin（HE）染色、Luxol fast blue（LFB）染色、免疫組織化學染色和免疫熒光染色方法步驟參照既往研究進行[10]，免疫染色中所用抗體和濃度分別為小鼠抗大鼠MBP（1∶500，Abcam）、兔抗大鼠 Olig2（1∶200，Gene Tex）、兔抗大鼠 Caspr（1∶300，Abcam）、抗兔和抗小鼠熒光二抗（1:500，CST）。

1.5統計學方法采用Graphpad Prism 7進行統計學分析，計量數據以x±s表示。水迷宮逃逸潛伏期使用重復測量設計方差分析，其余數據滿足正態分布及方差齊性情況下組間比較使用t檢驗。，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1死亡率假手術組9只大鼠全部存活，RHRSP/2VO組9只大鼠收縮壓均達180 mmHg以上，3只大鼠在雙側頸總動脈夾閉后1 d死亡，其余6只RHRSP/2VO組大鼠存活。

圖1 水迷宮結果逃逸潛伏期和穿越平臺次數。A為定位航行試驗逃避潛伏期；B為空間探索試驗穿越平臺次數；*表示與假手術組相比，P＜0.05

2.2 Morris水迷宮實驗結果定位航行實驗表明在雙側頸總動脈夾閉術后第12周手術組與假手術組逃逸潛伏期均逐漸下降，第1、2天手術組和假手術組逃逸潛伏期無統計學差異，第3～5天手術組和假手術組逃逸潛伏期有統計學差異（P＜0.05）；第6天手術組穿越平臺次數（2.33±0.76,n=6）較假手術組（5.56±0.63,n=9）減少，有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 HE染色手術組在雙側頸總動脈夾閉術后第12周后觀察到腦內高血壓性小動脈硬化、玻璃樣變；假手術組小動脈無內膜增厚、無管腔狹窄。

2.4 LFB染色手術組在雙側頸總動脈夾閉術后第12周后觀察到側腦室旁雙側胼胝體出現髓鞘條索狀脫失紊亂、形成空泡；假手術組在同一時間點同一部位的胼胝體纖維排列緊密有序。

圖2 病變部位 HE、LFB、MBP免疫組化結果（400×）。圖A為手術組大腦切片HE染色圖，黑色箭指小動脈硬化、內膜增厚、玻璃樣變；圖B為假手術組大腦切片HE染色，白色箭指正常的小動脈。圖C為手術組胼胝體出現條索狀、空泡狀脫髓鞘改變（黑色箭）；圖D為假手術組胼胝體髓鞘緊密排列，無脫失。圖E為手術組胼胝體出現條索狀、空泡狀脫髓鞘改變（黑色箭）；圖F為假手術組胼胝體染色均勻。Bar=50μm

圖3 少突膠質細胞免疫熒光染色（200×）。對比假手術組，手術組胼胝體病變部位少突膠質細胞明顯減少。Bar=100 μm

圖4 Caspr免疫熒光染色 （1000×）圖A是手術組腦白質病變部位；圖B是假手術組對應部位；圖C、D、E是手術組腦白質病變病灶周圍髓鞘正常區域；圖F是兩組郎飛結長度統計圖；圖C中放大區域可見郎飛結長度增加。Caspr代表郎飛結結側區，相鄰結側區之間的間隙為郎飛結長度；白色星號指直徑增粗的結側區,白色箭頭指病態延長的結側區；*表示與假手術組相比，P＜0.05。Bar=10 μm

2.5 MBP免疫組化染色手術組免疫組化染色出現胼胝體纖維紊亂，出現空泡；假手術組胼胝體染色均勻。纖維排列緊密。

2.6免疫熒光染色少突膠質細胞免疫熒光染色顯示：相對假手術組，手術組頸總動脈夾閉術后第12周胼胝體病變區域少突膠質細胞減少；結側區特異性蛋白-Caspr免疫熒光染色顯示：手術組術后第12周胼胝體白質纖維軸索結側區缺失，對照組假手術后第12周相應部位結側區規則排列；手術組術后第12周胼胝體脫髓鞘部位的周圍髓鞘正常的白質區域纖維軸索郎飛結長度增加 （P＜0.05）、結側區直徑增粗、長度延長。

3 討論

本研究發現正常腦白質富含排列規則的Caspr,而RHRSP-2VO模型除了具有典型的腦白質脫髓鞘及小動脈硬化的病理改變，還存在病變區域Caspr表達明顯減少，病變周圍髓鞘正常區域郎飛結和結側區長度增加、結側區增粗的異常病理改變，說明腦白質病變是髓鞘和軸索共同損傷的過程。

郎飛結兩側的結側區是軸索與少突膠質細胞相互作用的關鍵部位，主要通過三種黏附分子（軸索上的接觸蛋白、Caspr、膠質細胞神經束蛋白-155）相互作用形成復合體，該區域對Na+、K+的高度聚集和分隔起重要作用[9,12-13]。本研究發現病變部位Caspr表達減少并且排列紊亂，說明慢性腦白質病變不僅僅是單純的髓鞘丟失，還存在軸索結側區結構和功能的破壞。結側區作為軸索重要組成部分，從功能上說，一方面，結側區是少突膠質細胞髓鞘成環包繞軸索的關鍵部位，該部位Caspr的缺失將影響軸索和少突膠質細胞的相互作用從而導致髓鞘不能形成[14-15]，這可能與少突膠質細胞功能紊亂及數量減少有關；另一方面，結側區作為屏障分隔郎飛結區的Na+通道和近結側區的K+通道[9]，結側區的缺失間接破壞了Na+的高度聚集狀態，阻礙了局部電位形成，繼而降低有髓神經纖維跳躍式傳導效率。因此，髓鞘丟失和結側區結構異常是腦白質病變的重要病理基礎，共同降低了中樞神經系統有髓神經纖維的傳導效率，繼而影響了認知功能。

郎飛結是有髓神經纖維的重要結構，含有高度聚集的Na+通道[16]，本研究中病變周圍尚未脫髓鞘部位出現的郎飛結的病態伸長，降低了Na+的平均密度，直接破壞了郎飛結處Na+高度聚集狀態，繼而降低了郎飛結跳躍式傳導的效率。從另一個角度來說，這些髓鞘正常部位的軸索損傷可能早于髓鞘脫失，那么軸索損傷是否在整個腦白質病變之前就已經出現，這種預測價值需要更多的實驗來探究。同時，本研究還發現病變周圍未脫髓鞘部位的結側區異常增粗與病態伸長，許多關于多發性硬化的研究表明，結側區的增粗和延長是髓鞘脫失的預測信號[17]，那么在RHRSP-2VO模型中，結側區的結構異常是否是腦白質慢性脫髓鞘的預測信號，其中的機制需要在疾病發生早期進一步研究。腦白質病變患者臨床表現無特異性，而且患者的臨床癥狀往往與其影像學顯示的病變性質和嚴重程度不一致[18]，單從局部病變區域的脫髓鞘改變無法合理解釋嚴重的臨床癥狀，這可能是由于目前無法從常規影像學觀察到脫髓鞘病灶周圍潛在的軸索損傷，另外這些軸索微結構損傷可能擴散到周邊或遠隔腦區，擾亂腦網絡的連接，影響全腦的有效通信繼而引起認知減退、步態異常和自主神經功能紊亂等表現[19]。本實驗的不足之處在于未能在更多的時間點和用多個不同指標全面評價軸索病理改變，軸索損傷及與腦白質病變的先后關系與機制需要進一步研究。

總而言之，慢性腦白質病變不僅有髓鞘丟失，同時還存在軸索損傷。軸索損傷可能是腦白質病變的潛在機制，軸索損傷的修復將是臨床腦白質病變治療的新領域。