人參對感染后小鼠腸黏膜的干預(yù)效果及對血清CRP、TNF-α、IL-6水平的影響

馮其麟 鄧艾平 劉玨等

[摘要] 目的 探討人參對感染后小鼠腸黏膜的干預(yù)效果及對血清C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平的影響。 方法 60只小鼠中，隨機抽取15只為空白對照組，剩余45只用于制備重癥腹腔感染模型（感染組）。然后再將45只小鼠模型采用隨機數(shù)字表法分為三組：模型組、抗炎組、抗炎+人參組，每組各15只。抗炎組給予亞胺培南/西司他丁333.33 mg/kg（腹腔注射，12 h/次），抗炎+人參組在抗炎組的基礎(chǔ)上給予人參皂苷Rb1（純度98%以上）50 mg/（kg·d）灌胃，模型組給予等量無菌生理鹽水腹腔注射。分別于治療后24、48、72 h取血標(biāo)本，每組每次5只，觀察各組小鼠腸黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平變化情況;留取末端回腸，行HE染色，觀察腸黏膜層情況，并計算腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)。 結(jié)果 重癥腹腔感染后，小鼠腸黏膜出現(xiàn)萎縮，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，且腸黏膜萎縮程度越明顯，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目越多。治療后72 h，抗炎+人參組重癥腹腔感染小鼠的CRP、TNF-α、IL-6水平顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），且下降幅度大于抗炎組（P < 0.05）;抗炎+人參組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于模型組和抗炎組（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 重癥腹腔感染可導(dǎo)致腸黏膜萎縮，腸黏膜萎縮與腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目有關(guān);人參對腸黏膜有保護作用，其能改善腸黏膜萎縮的癥狀，減少對腸黏膜分泌物的影響。

[關(guān)鍵詞] 腹腔感染;腸黏膜;人參;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R656? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（a）-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of ginseng on intestinal mucosa and the levels of serum C-reactive protein （CRP）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in mice after infection. Methods Among 60 mice， 15 mice were randomly selected as blank control group， and the remaining 45 mice were used to prepare severe abdominal infection model （infected group）. Then 45 mice models were divided into three groups by the random number table method： model group， anti-inflammatory group， anti-inflammatory + ginseng group， with 15 mice in each group. The anti-inflammatory group was given Imipenem/Cilastatin 333.33 mg/kg （intraperitoneal injection， once 12 h）; the anti-inflammatory + ginseng group was given intragastric administration of ginsenoside Rb1 （purity>98%） 50 mg/（kg·d） on the basis of the anti-inflammatory group; the model group was given the same amount of sterile saline by intraperitoneal injection. Blood samples were taken at 24， 48 h and 72 h after treatment. Five rats in each group were used to observe the changes of CRP， TNF-α and IL-6 levels in the intestinal mucosa of mice in each group; the terminal ileum was harvested and HE staining was performed. The intestinal mucosal layer was observed and the intestinal epithelial cell apoptosis index was calculated. Results After severe intraperitoneal infection， mice intestinal mucosal atrophied， intestinal epithelial cell apoptosis increased significantly， and the more obvious the intestinal mucosal atrophied， the greater the number of intestinal mucosal epithelial cell apoptosis was. After treatment for 72 h， the levels of CRP， TNF-α and IL-6 in mice with severe intraperitoneal infection of anti-inflammatory + ginseng group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the decrease range was greater than that of anti-inflammatory group （P < 0.05）; the apoptotic index of anti-inflammatory + ginseng group was significantly lower than that of the model group and the anti-inflammatory group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Severe abdominal infection can cause intestinal mucosal atrophy， intestinal mucosal atrophy is related to the number of intestinal epithelial cell apoptosis; ginseng has a protective effect on the intestinal mucosa， which can improve the symptoms of intestinal mucosal atrophy， reduce the impact on intestinal mucosal secretions.

[Key words] Intraperitoneal infection; Intestinal mucosa; Ginseng; Cell apoptosis

臨床發(fā)現(xiàn)腹腔感染較重或者腹腔感染病史較長的患兒，會出現(xiàn)腹脹、腹瀉等消化不良表現(xiàn)。這可能是因為重癥腹腔感染時，腸黏膜萎縮，腸黏膜上皮細(xì)胞大量凋亡，同時腸黏膜內(nèi)分泌功能受到影響，導(dǎo)致了腸功能紊亂[1-2]。研究表明，人參制劑及其有效成分對腸黏膜具有一定的保護作用[3]，但其機制尚不明確，為此本研究擬從腹腔感染動物模型中，探尋出腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡與腸黏膜萎縮的關(guān)系，以及人參對腸黏膜保護的影響。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠60只，平均體重（20.3±0.5）g，合格證號：SCXK（鄂）2015-0018，由湖北省動物實驗研究中心提供，動物飼養(yǎng)和處理嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物飼養(yǎng)和使用指南。

1.2 儀器與試劑

光學(xué)顯微鏡[Axio Imager A2m，卡爾蔡司（上海）管理有限公司];Olympus CX31顯微鏡;低溫高速離心機[德國Eppendorf（R430型）];全自動生化分析系統(tǒng)（貝克曼庫爾特AU480，試劑盒為上海康朗生物科技有限公司產(chǎn)品）;普通冰箱（海爾）;Laica HZ1210石蠟切片機（德國）;電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;DS-425電子秤（上海寺岡電子有限公司）。

1.3 實驗方法及分組

60只雄性C57BL/6小鼠采用隨機分組方式抽取15只為空白對照組，另外45只用于重癥腹腔感染動物模型制備（感染組）。然后再將45只小鼠模型采用隨機數(shù)字表法隨機分為三組：模型組、抗炎組、抗炎+人參組，每組各15只。模型制備后予以治療干預(yù)。抗炎組給予亞胺培南/西司他丁333.33 mg/kg，腹腔注射，12 h/次;抗炎+人參組在抗生素的基礎(chǔ)上，給予人參皂苷Rb1（純度98%以上）50 mg/（kg·d）灌胃;模型組給予等量無菌生理鹽水腹腔注射。每組每次取5只小鼠，分別于治療后24、48、72 h取血標(biāo)本，觀察各組小鼠腸黏膜C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平變化情況;剖殺，取末端回腸，行蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.4 重癥腹腔感染動物模型制備

雄性C57BL/6小鼠于模型制作12 h前禁食，不禁水。模型制備：向腹腔內(nèi)注入25%滅菌糞便混懸液2 mL/kg，大腸埃希菌液及親水氣單胞菌液各1 mL/kg。

造模成功的評價標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Chiu腸黏膜損傷評分法，小腸黏膜損傷程度為3～4級。光鏡下模型組小腸黏膜和黏膜下層間質(zhì)水腫、血管充血，有中性粒細(xì)胞浸潤，腸絨毛毛細(xì)血管充血，部分區(qū)域有黏膜上皮脫落，甚至完全脫失，漿膜層明顯炎性滲出。

1.5 CRP、TNF-α、IL-6水平監(jiān)測

取血標(biāo)本3 mL，離心獲得血清，離心速率3200 r/min，離心時間10 min，離心半徑8 cm。采用采用酶聯(lián)免疫吸附法（貝克曼庫爾特AU480）檢測小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平。

1.6 腸黏膜層觀察及腸黏膜細(xì)胞凋亡檢測

收集樣本，留取末端回腸（距回盲部約10 cm）長度約5 mm，回腸組織于4%多聚甲醛緩沖液中固定，進行石蠟包埋，常規(guī)切片進行HE染色，觀察腸道黏膜層情況;另留取部分石蠟切片用于細(xì)胞凋亡檢測。腸黏膜上皮細(xì)胞核染色呈棕褐色的即為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)的計算：每張切片隨機選取5個不連續(xù)的高倍鏡視野計數(shù)陽性細(xì)胞，計數(shù)每條小腸絨毛中陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)，每張切片結(jié)果取平均值即為樣本的凋亡指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

收集整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸黏膜病理改變

60只小鼠在剖殺處理前均存活。重癥腹腔感染24 h后，光鏡下模型組小腸黏膜和黏膜下層間質(zhì)水腫、血管充血，有中性粒細(xì)胞浸潤，腸絨毛毛細(xì)血管充血，部分區(qū)域有黏膜上皮脫落，甚至完全脫失，漿膜層明顯炎性滲出，腹腔感染24 h后，腸黏膜損傷達(dá)高峰（圖1）。抗炎組也可見類似表現(xiàn)，但較對照組明顯減輕，大片絨毛壞死脫落少見。抗炎+人參組有部分絨毛輕微水腫，頂端上皮受損。

2.2 各組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.3 各組小鼠腸黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平比較

3 討論

腸屏障包括機械屏障、免疫屏障、生物屏障、化學(xué)屏障。機械屏障由上皮層、上皮頂端的緊密連接和黏液層及黏膜血管內(nèi)皮組成[4]。上皮層是由一層單層柱狀上皮細(xì)胞緊密排列于腸腔構(gòu)成，是腸與外界環(huán)境之間最主要的組織屏障[5]。上皮頂端之間的緊密連接由多種蛋白質(zhì)復(fù)合物組成，對物質(zhì)轉(zhuǎn)運起選擇作用，可以阻止大分子的進入。黏液層由腸杯狀細(xì)胞分泌，覆蓋上皮表面，可阻止細(xì)菌的穿透，稀釋、沖刷、黏附有毒物質(zhì)。正常情況下，腸道正常菌群可抑制其他侵入性微生物的增殖。一旦此平衡紊亂，優(yōu)勢繁殖的細(xì)菌便可突破黏膜屏障而移位[6]。

腹腔感染后，腸蠕動功能改變，與腸黏膜屏障損傷有關(guān)[7]。本研究顯示，重癥腹腔感染后，小鼠腸黏膜出現(xiàn)萎縮，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，且腸黏膜萎縮程度越明顯，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目越多。黏膜上皮機械屏障是由上皮細(xì)胞刷狀緣的嚴(yán)密的脂質(zhì)雙分子層以及細(xì)胞側(cè)緣一連串的細(xì)胞連接組成的。生理情況下，腸黏膜上皮細(xì)胞不斷地衰老、死亡和脫落，并不斷地由上皮中的未分化細(xì)胞增殖補充，這是生理性的更新。當(dāng)炎癥或創(chuàng)傷等原因造成上皮損傷后，上皮細(xì)胞具有較強的再生和修復(fù)能力，即上皮細(xì)胞凋亡和增殖在一定范圍內(nèi)能維持動態(tài)平衡，保護機體免受細(xì)菌毒素等外界不良因素的侵襲[8-9]。細(xì)胞凋亡程序有多個途徑，其中包括經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要細(xì)胞器[10-11]。細(xì)胞進化出一套完整的機制來監(jiān)督和幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與修飾。而當(dāng)錯誤折疊的蛋白質(zhì)累積時，細(xì)胞通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對其進行應(yīng)答，包括增強蛋白質(zhì)折疊能力、停滯大多數(shù)蛋白質(zhì)的翻譯、加速蛋白質(zhì)的降解等。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂持續(xù)，細(xì)胞將最終啟動Caspase12依賴的細(xì)胞凋亡程序[12]。

既往關(guān)于重癥急性胰腺炎的研究中[13]，從動物模型中采取部分腸黏膜，通過觀察，發(fā)現(xiàn)重癥急性胰腺炎發(fā)生時可見腸道黏膜水腫，腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接遭到破壞，腸道上皮細(xì)胞凋亡增加，腸微絨毛高度降低，腸道系膜血管收縮，血流量減少，嚴(yán)重者腸黏膜出現(xiàn)潰瘍、壞死，腸黏膜出現(xiàn)萎縮，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，同時腸黏膜細(xì)胞內(nèi)分泌功能出現(xiàn)改變。成紅剛等[14]也通過對腹腔感染后的大鼠腸黏膜絨毛高度、腸上皮損傷指數(shù)和各相應(yīng)時間點血漿D-乳酸含量進行研究得出：腹腔感染后12 h，大鼠腸絨毛高度明顯降低，血漿D-乳酸含量明顯升高，腸黏膜損傷評分增加（P < 0.01），且大鼠血漿D-乳酸水平與小腸絨毛高度呈負(fù)相關(guān)（P < 0.01），與腸黏膜損傷指數(shù)呈正相關(guān)（P < 0.01）。

人參為五加科人參屬植物，主要活性成分為人參皂苷。現(xiàn)代藥理研究表明，人參皂苷具有抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老、保護心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)的作用。隨著人參藥用和保健價值的不斷發(fā)掘，其有效成分人參皂苷也引起人們越來越多的關(guān)注[15-17]。李茜等[18]發(fā)表文獻(xiàn)指出：人參皂苷Rg1對大鼠腸缺血或再灌注后的腸道有保護作用，該保護作用可能與減少TNF-α、IL-6、MDA含量和提高SOD活性有關(guān)。而劉艷艷等[19]通過對小鼠給予人參皂苷灌胃得出：人參皂苷灌胃13 d后，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生明顯改變，推測人參皂苷可能以腸道菌群作為發(fā)揮生物學(xué)作用的靶點，進而起到保護腸黏膜屏障功能的作用。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可作用于多種細(xì)胞，從而激發(fā)一系列的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致機體釋放大量的IL-6和IL-8等，進一步促進膿毒癥的發(fā)展[20-21]。IL-6作為一種前炎性細(xì)胞因子，與膿毒癥的病情呈正相關(guān)。CRP是炎性反應(yīng)的常用檢測指標(biāo)，可反映機體炎性反應(yīng)水平。本研究中，抗炎組、抗炎+人參組的小鼠腸黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平均顯著低于模型組（P < 0.05或P < 0.01），且抗炎+人參組的小鼠腸黏膜CRP、TNF-α、IL-6水平較抗炎組更低（P < 0.05），提示人參有助于降低重癥腹腔感染后小鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)水平。

本研究結(jié)果顯示人參皂苷可抑制腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡。既往研究表明，含有人參的中成藥，如參附注射液具有抗缺血、缺氧、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化等作用，對多種器官的缺血再灌注損傷等具有保護作用[22]。有研究證實人參對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重復(fù)蛋白有很好的清除作用[23]。是否因其清除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常蛋白，從而減緩了細(xì)胞凋亡的啟動進程，最終起到保護腸黏膜屏障功能的作用需要進一步研究證實。

本研究通過重癥腹腔感染動物模型提示：重癥腹腔感染后，腸黏膜萎縮與腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡增多有關(guān)，從而影響腸黏膜細(xì)胞內(nèi)分泌功能，盡早予以中藥人參，可以減少因此引起的細(xì)胞凋亡，減輕腸黏膜萎縮，從而降低對腸黏膜分泌功能的影響，減改善腸功能紊亂。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 張艷敏，崔乃強，張淑坤.引流腸系膜淋巴液對重癥腹腔感染大鼠腸黏膜屏障功能的影響[J].中華胃腸外科雜志，2014，17（7）：711-715.

[2]? Zuzana evíková，Ján Blanár，Andrea Lauková，et al. Effect of Enterococcus faecium EF 55 on morphometry and proliferative activity of intestinal mucosa in broilers infected with Salmonella Enteritidis [J]. J Vet Res，2016，60（3）：261-265.

[3]? 蔡景融，武華，程鞏，等.牛磺酸對嚴(yán)重腹腔感染大鼠腸黏膜屏障功能的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（7）：22-24.

[4]? Wu CT，Zheng YB. Expression of proliferating cell nuclear antigen of the intestinal mucosa during critical intraperitoneal infection [J]. Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue，2004，16（12）：738-739.

[5]? 胡培陽，屠巍巍，胡曉飛，等.參附注射液對腹腔感染大鼠腸屏障功能的影響[J].中國急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學(xué)雜志，2013，8（5）：437-439.

[6]? 于泳，鄭鵬遠(yuǎn).腸道細(xì)菌、腸黏膜屏障與腸功能障礙[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（2）：121-122.

[7]? 趙曉琴，陳英，鄺曉聰，等.腹內(nèi)高壓對腸黏膜屏障功能損傷的影響[J].世界華人消化雜志，2013，21（34）：3790-3798.

[8]? 趙磊，林江.腸上皮細(xì)胞緊密連接在腸易激綜合征發(fā)病中的作用[J].胃腸病學(xué)，2018，23（3）：181-184.

[9]? 王希，廖呂釗，江榮林.腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)功能及其調(diào)節(jié)[J].浙江醫(yī)學(xué)，2018，40（8）：895-898.

[10]? 王碩，孟慶華，秦秀德，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012，12（5）：632-635.

[11]? 邱志凌，張軍平，郭曉辰.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究進展[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2014，36（1）：102-107.

[12]? 謝汝佳.Calpain2及其抑制蛋白Calpastatin在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用[D].貴陽：貴陽醫(yī)學(xué)院，2014.

[13]? 雷秋成.胰高血糖素樣肽-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸黏膜屏障損傷的保護作用研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2016：1-121.

[14]? 成紅剛，丁連安，曲林林，等.腹腔感染大鼠腸屏障功能損傷研究[J].腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2012，19（2）：111-114.

[15]? Ye YJ，Lu YS，Zhou X，et al. Protective Effects of Acupuncture Intervention Against Damage of Intestinal Mucosal Barrier Induced by 5-Fluorouracil in Rats [J]. Zhen Ci Yan Jiu，2016，41（2）：95-99.

[16]? 姚夢杰，呂金朋，張喬，等.人參化學(xué)成分及藥理作用研究[J].吉林中醫(yī)藥，2017，37（12）：1261-1263.

[17]? 劉燃，孫林，張戈.人參皂苷Rg1對缺血再灌注損傷的保護機制研究進展[J].中國循環(huán)雜志，2014，29（1）：77-79.

[18]? 李茜，張彥敏，關(guān)玥，等.人參皂苷Rg1對大鼠腸缺血/再灌注損傷的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2010，26（3）：358-361.

[19]? 劉艷艷，張凱，關(guān)家偉，等.人參皂苷對BALB/c小鼠腸道菌群的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2015，15（6）：1041-1045.

[20]? 徐文，曹輝，楊遠(yuǎn)榮，等.人參皂苷Rh2的藥理活性研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，14（28）：42-45.

[21]? 譚婉賢，熊晏，賴?yán)蛎簦?5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)小鼠化療性腸黏膜炎模型的建立[J].中國實驗動物學(xué)報，2018，26（3）：372-377.

[22]? 田蕓，任黔玲.參附注射液治療急性胰腺炎臨床探討[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2007，9（10）：98-99.

[23]? 張學(xué)禮，韓志芬，夏花英，等.20（S）-PPD促內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，29（3）：70-75.

（收稿日期：2018-09-08? 本文編輯：張瑜杰）