唑來膦酸對MC3T3-E1細胞增殖及Runx2、Osterix表達變化的影響

張廣潤 ，邵菲菲 ，楊 譯 ，郭天康 ，田利民

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

骨質疏松（osteoporosis，OP）是由于骨量減少、骨顯微結構退化，導致骨脆性增加以及容易發生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。唑來膦酸（ZA）作為第三代二膦酸鹽，可以阻止骨流失，增加骨量，效果是前兩代二膦酸鹽的100～850倍[2]。眾多研究發現，唑來膦酸不僅對破骨細胞發揮作用，其在改變成骨細胞的增殖與分化過程中同樣扮演著重要角色。Runx2是成骨細胞分化和骨形成過程中最早出現且最具特異性的轉錄因子[3]，而Osterix（Osx）是繼Runx2之后發現的成骨細胞特異性轉錄因子，作為Runx2的下游基因在骨形成方面發揮重要作用[4]。本實驗研究第三代二膦酸鹽唑來膦酸對小鼠MC3T3-E1細胞增殖的影響以及與成骨分化有重要關系的 Runx2、Osterix的表達情況，探究唑來膦酸引起骨量增加的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1細胞），購自中橋新舟生物有限公司。

1.2 試劑和儀器

DMEM/low glu培養基（Hyclone，美國）；胎牛血清，胰蛋白酶（Gibco，美國）；Runx2、Osterix和 GAPDH 抗體（ABCAM，美國），ECL化學發光試劑盒，CCK-8試劑盒，青鏈霉素混合液（100 X）（Solarbio，北京），Trizol試劑盒（Invitrogen，美國）；唑來膦酸（恒瑞醫藥，江蘇），逆轉錄試劑盒，qRT-PCR試劑盒（Promega）；5%二氧化碳培養箱（MCO-18AIC，日本）；超凈工作臺（Heal force）；實時熒光定量PCR儀（ABI，美國），Gel DocTM XR+凝膠成像儀（BIO-RAD，美國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus，日本）；酶標儀（BIO-TEK，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養 將MC3T3-E1細胞株培養于DMEM/low glu培養基（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）中，細胞培養箱內5%CO2、37℃常規培養，2 d換液一次，3～4 d傳代一次，待細胞進入對數生長期后進行實驗。

1.3.2實驗藥物的制備 將唑來膦酸粉末溶于PBS中，制成濃度為10-2mol/L的儲備液，保存在-20℃冰箱中，使用時用DMEM/low glu培養基稀釋成濃度為10-3mol/L、10-8mol/L的培養基。

1.3.3四唑藍比色試驗（MTT）檢測MC3T3-E1細胞增殖活性調整MC3T3-E1細胞密度為1.5×104/ml，培養24 h后，更換新鮮培養液，分別加入不同濃度（10-3mol/L、10-8mol/L）的唑來膦酸溶液及生理鹽水（10 μl/孔），每種質量濃度平行做6份。添加24、48、72、96 h 后各培養孔用 PBS洗一遍，每孔加 100 μl DMEM/low glu培養液，同時加入10 μl 10.5%的四甲基偶氮唑藍，繼續培養4 h，棄去培養液，每孔加 100 μl DMSO，振蕩 10 min，在酶標儀上測定波長490 nm處的吸光度（A）。

1.3.4 qRT-PCR檢測基因的表達 將MC3T3-E1細胞以1×105/ml的密度接種于6孔板上，24 h后更換培養液，加入兩種濃度（10-3mol/L、10-8mol/L）的唑來膦酸溶液處理，培養72 h后，每孔加入1 ml Trizol，提取總RNA。按照promega A5000 GoScript TM試劑盒說明書將 mRNA反轉錄為cDNA，應用 promega A5000 GoScript TM試劑盒進行熒光定量PCR實驗（引物序列見表1），檢測Runx2、Osterix基因表達水平。實驗步驟：第一步：95℃預變性2 min；第二步：95℃變性15 s，60℃退火+延伸60 s，共40 個循環；第三步：繪制熔解曲線（Dissociation），以 β-actin為內參，使用2-△△CT法計算相對定量。

1.3.5 Western Bloting檢測蛋白表達水平 MC3T3-E1細胞以1×105/ml密度接種于6孔板，24 h后更換培養液，分別以兩種濃度的唑來膦酸處理，培養3 d后，用PBS洗3遍，加入細胞裂解液后4℃條件下裂解30 min，800 x離心5 min；每孔加入RIPA裂解液100 μl，按1∶100的比例于裂解液中加入蛋白酶抑制劑（PMSF）。利用BCA蛋白質檢測試劑盒檢測蛋白質濃度，并將相同量的蛋白質加入PAGE凝膠進行電泳分離，然后轉移至膜上。室溫下，在脫色搖床上搖動封閉1 h，分別用兔抗鼠Runx2、Osterix一抗孵育，4℃過夜，第二天 TBST洗3遍，每次10 min。二抗孵育2 h，底物化學發光ECL顯色，Gel DocTM XR+凝膠成像儀曝光后進行圖像分析。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。實驗結果以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 唑來膦酸對MC3T3-E1細胞增殖的影響

使用MTT法檢測MC3T3-E1細胞增殖水平，可以看出，24 h時各組細胞OD值無顯著性差異，從48 h開始，高濃度組細胞增殖明顯受到抑制，與對照組比較差異具有顯著性（P＜0.05），而低濃度組OD值與對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。說明高濃度（10-3mol/L）ZA會明顯抑制成骨細胞增殖，低濃度（10-8mol/L）ZA則不影響成骨細胞增殖（見表2）。

表2 唑來膦酸作用下MC3T3-E1細胞OD值變化（x±s）

2.2 唑來膦酸對Runx2、Osterix基因表達水平的影響

圖1 唑來膦酸對Runx2及Osterix基因表達水平的影響

圖2 唑來膦酸對Runx2及Osterix蛋白表達水平的影響

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，72 h后，高濃度組Runx2基因表達水平較對照組明顯降低（P＜0.05），而低濃度組Runx2基因表達水平明顯升高（P＜0.01）；高濃度組 Osterix基因表達水平較對照組明顯降低（P＜0.01），而低濃度組Osterix基因表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖1。

2.3 唑來膦酸對Runx2、Osterix蛋白表達水平的影響

Western Blotting檢測結果顯示，高濃度組Runx2和Osterix蛋白表達水平較對照組明顯降低，但低濃度組Runx2及Osterix蛋白表達水平則明顯升高（P＜0.01），與對照組差異具有顯著性，見圖2。

3 討論

成骨細胞對骨形成至關重要，參與了骨基質的合成、分泌及礦化。Runx2和Osterix是成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，在骨發育的不同階段發揮重要作用。

唑來膦酸是作用較強的骨吸收抑制劑，通過阻斷甲羥戊酸通路抑制破骨細胞生成，促使破骨細胞凋亡，減少骨吸收，降低骨轉換，增加骨量[5]。研究表明，第二代二膦酸鹽對成骨細胞增殖、分化及礦化均有促進作用，且濃度為10-8mol/L時效果最佳[6-7]，低濃度唑來膦酸對成骨細胞增殖幾乎沒有影響[8-9]，高于10-5mol/L濃度的唑來膦酸對成骨細胞增殖具有抑制作用[8]。

我們發現唑來膦酸在濃度10-3mol/L時對小鼠成骨細胞具有細胞毒性，在濃度為10-8mol/L時對成骨細胞增殖幾乎不產生影響，且不隨時間變化發生改變。

Runx2是骨形成過程中最早和最具特征性的標志[10-11]。Osterix是具有鋅指基序結構域的成骨特異性轉錄因子，僅在成骨細胞中特異性表達，存在于Runx2下游，基因序列中有Runx2結合位點，受其正向調控，主要在成骨分化晚期發揮作用[12]。本研究發現，低濃度（10-8mol/L）ZA對體外培養的成骨細胞沒有毒性，并且能調節與成骨細胞分化相關的Runx2、Osterix的基因及蛋白表達水平，與之前的研究結果相似[13-14]，高濃度ZA能抑制其表達，阻止成骨細胞分化。

本研究為研究唑來膦酸對成骨細胞的作用機制提供了依據，但尚未進行動物實驗，在細胞水平無法準確模擬體內釋放唑來膦酸的生理過程和藥物劑量，還需要通過動物體內實驗進一步驗證。