結核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時檢測和核酸檢測對涂陰肺結核病早期診斷的價值

范大鵬，張艷，陳園園，鮑志堅

（杭州市紅十字會醫(yī)院，浙江 杭州 310003）

根據第五次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，我國涂陰肺結核人群是涂陽肺結核人群的5.9倍[1]。但是由于缺乏病原學依據，涂陰肺結核的診斷比較困難。分子診斷技術可將肺結核病原學診斷技術分為傳統細菌學檢驗技術和依賴于核酸擴增技術的結核分枝桿菌快速檢測技術，其中結核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時檢測技術（SAT-TB）和結核/非結核核酸檢測（基于結核分枝桿菌DNA檢測技術）就是其中具有代表性的分子檢測技術。本研究收集涂陰疑似肺結核患者的肺泡灌洗液進行960快速培養(yǎng)，并采用SAT-TB和結核/非結核核酸檢測技術，評價兩種分子診斷技術對涂陰肺結核早期快速診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年10月-2018年3月本院疑似肺結核的患者726例。入選標準：（1）胸片顯示肺部陰影，臨床疑似肺結核。（2）痰涂片抗酸染色連續(xù)3次陰性。排除標準：（1）經支氣管鏡檢查灌洗液標本抗酸染色涂片為陽性。（2）臨床進行支氣管鏡檢查且無陽性發(fā)現者。根據肺結核診斷標準[2]，將726例分為涂陰肺結核組603例和非肺結核組123例。非肺結核組為無肺結核病病原學和病理診斷依據，無活動性肺結核的臨床表現，經過其他非抗結核治療后肺部病灶好轉者，男76例，女47例，年齡（45.9±17.1）歲。603例涂陰肺結核患者按照“經灌洗液快速培養(yǎng)結核分枝桿菌是否為陽性”進一步分為灌洗液陽性組271例，其中男160例，女111例，年齡（43.9±19.4）歲；灌洗液陰性組 307 例，即灌洗液快速培養(yǎng)結核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，但影像學與活動性肺結核相符，具有咳嗽、咯痰、午后低熱、盜汗等臨床肺結核癥狀，且經過診斷性抗結核治療后肺部病灶吸收好轉，其中男187例，女120例，年齡（45.3±18.7）歲；其余25例根據非結核分枝桿菌病診斷與治療專家共識[3]，納為肺分枝桿菌病組，其中男 11 例，女 14 例，年齡（45.5±19.5）歲。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 TGL-16G高速離心機，快速分枝桿菌培養(yǎng)試劑盒（960），LightCycler480熒光定量PCR，SLAN-96S熒光定量PCR，960結核分枝桿菌快速培養(yǎng)試劑盒（美國BD公司，批號：705201），SAT-TB檢測試劑盒 （上海仁度生物技術有限公司，批號：20171201），分枝桿菌核酸檢測試劑盒（博奧生物有限公司，批號：20171109）。

1.2.2 檢測方法 收集患者肺泡灌洗液10～15mL，混勻后均分3份分別進行960快速培養(yǎng)并行SATTB和結核/非結核核酸檢測。（1）960結核分枝桿菌快速培養(yǎng)。無菌吸管吸取3～5mL肺泡灌洗液標本放入50mL離心管，后加入等體積NALC-NaOH混合后震蕩并開始計時15分鐘。打開管蓋加PBS（pH=6.8）50mL，充分混勻放離心機中以相對離心力為3000×g離心。棄上清液，用無菌吸管加入1～2mL PBS（pH=6.8）混勻。取出0.5mL該混勻液加入有0.8mL生長添加劑/抑菌劑專用的960液體培養(yǎng)管中，掃描培養(yǎng)管上條形碼放入孵育箱中進行培養(yǎng)。儀器報陽后進行抗酸染色，確認后報陽性生長時間，陰性結果42天后機器自行報告。（2）結核分枝桿菌RNA恒溫擴增（SAT-TB檢測）。肺泡灌洗液標本中加入4%NaOH進行消化 （劑量少于標本量的1.5倍）。根據SAT-TB試劑盒說明書操作。（3）結核/非結核核酸檢測。根據檢測試劑盒說明書對肺泡灌洗液進行操作，Ct值＜40為陽性，結果解讀詳見表1。

表1 結核和非結核核酸檢測結果解讀

1.2.3 960快速培養(yǎng)陽性菌株菌種鑒定 （抗原法）取960快速培養(yǎng)陽性物100μL加入結核分枝桿菌抗原MPB64檢測板的加樣孔中，15分鐘后判讀結果。結果判讀C（質控區(qū)）和T（檢測區(qū)）均出現紅色線為結核分枝桿菌陽性，僅C出現紅色線為結核分枝桿菌陰性，C未出現紅色線表示反應板失效，需重新試驗。

1.3 統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，以臨床診斷[2]為標準計算三種方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和尤登指數。

2 結果

2.1 檢測速度 960快速培養(yǎng)法對灌洗液標本的檢測時間為（32.3±4.4）天，SAT-TB 和結核/非結核核酸檢測時間為0.5天。兩種分子診斷技術檢測肺泡灌洗液標本時間較傳統960快速培養(yǎng)法明顯縮短。

2.2 診斷效能 以最終的臨床診斷為金標準，結核/非結核檢測的診斷效能最高，尤登指數為0.52，其次為SAT-TB，尤登指數為0.51，最后為960快速培養(yǎng)，尤登指數為0.47。詳見表2。

表2 三種檢測方法的診斷效能

3 討論

SAT-TB是以其特異的16SrRNA為靶標，通過42℃恒溫擴增對靶標進行RNA擴增產生熒光信號，并對熒光信號進行實時檢測并判斷標本中是否存在活菌的一種檢測結核分枝桿菌的方法。以臨床診斷為最終診斷標準，本文結果提示，在涂陰肺結核SAT-TB檢測肺泡灌洗液的總檢出率為50.8%，略高于范琳等[4]對涂陰肺結核患者灌洗液進行SAT-TB檢測的檢出率40%；SAT-TB診斷的敏感度為50.8%、特異度為99.2%，與文獻報道[5-7]的敏感度81.0%～97.8%、特異度84.2%～100%基本一致。但觀察中發(fā)現，SAT-TB技術存在一定的漏檢率，臨床診斷中如遇到SAT-TB檢測陰性，要結合患者的其他指標作出最終診斷。

結核/非結核核酸檢測結核分枝桿菌技術是針對核酸上的靶序列進行擴增，通過2個通道進行結核分枝桿菌和分枝桿菌的檢測。該技術不會區(qū)分活菌和死菌。本文中肺分枝桿菌病組中結核/非結核核酸檢測NTM-DNA全部陽性，而960快速培養(yǎng)檢測陽性率只有46.8%，結核/非結核核酸檢測陽性率為52.4%，也說明了該技術會檢測出一部分死菌。本文中肺分枝桿菌病組中結核/非結核核酸檢測NTM-DNA全部陽性，可見該技術在早期防止分枝桿菌誤診為肺結核病有一定優(yōu)勢。但本研究入選分枝桿菌病患者太少，有些問題尚不能充分暴露，還要擴大樣本繼續(xù)研究。

在檢測時間上，SAT-TB和結核/非結核核酸檢測僅需0.5天，傳統結核菌病原學診斷時間需1個月左右，SAT-TB在時效上有很大的優(yōu)勢。兩種分子檢測技術檢出效能也都略高于960快速培養(yǎng)，在檢測診斷的時效性上較有優(yōu)勢。

兩種分子檢測技術和960快速培養(yǎng)仍有一定檢測結果差異，特別是在臨床診斷為涂陰肺結核組中差異更大。究其原因，可能與該組基本臨床癥狀均不明顯、病情較穩(wěn)定、體內細菌數較少有關。雖然SATTB檢測的敏感度高，但是RNA極易降解，如果實驗時操作處理不當就會造成漏檢。SAT-TB敏感度在臨床確診為涂陰肺結核病組的敏感度略高于結核/非結核核酸檢測，但在臨床診斷為涂陽肺結核組中低，說明SAT-TB檢測技術可以檢測活菌和死菌。

分子檢測技術操作時需注意污染問題。本文在非肺結核患者中兩種分子檢測都有1例假陽性檢出，可能與在SAT-TB檢測時標本被污染有關，而結核/非結核核酸檢測可能是由于支氣管鏡消毒殺菌后清洗不干凈而殘留DNA引起。

綜上所述，兩種分子檢測技術均具有960快速培養(yǎng)的檢測能力，對涂陰肺結核病提供病原學依據對肺結核病的早期確診有很大幫助。