超靈敏敞開式質譜免疫分析用于血清及細胞表面的多蛋白同時檢測

徐姝婷，馬 雯，白 玉，劉虎威

(北京分子科學國家研究中心，北京大學化學與分子工程學院，分析化學研究所，北京 1000871)

研究背景：膜蛋白或分泌蛋白作為疾病的臨床檢測標志物和治療靶標，對其表達水平的準確、快速、高靈敏檢測具有重要的意義。傳統酶聯免疫吸附測定以及基于熒光或電化學的免疫測定方法，一定程度滿足了高靈敏度及分析通量要求，但卻存在譜帶重疊、背景干擾嚴重、標記探針數量有限等瓶頸，限制其在少量樣品中多目標同時檢測中的應用。質譜具有高靈敏、高質量分辨率、定量準確等優勢，目前，蛋白標志物的質譜檢測主要包括直接測定以及基于元素標簽和ICP-MS的質譜免疫方法，前者存在基質效應嚴重，離子化效率低，檢測靈敏度不足問題；后者需要借助無機質譜和金屬元素標簽試劑增加分析成本，限制方法的簡便和可拓展性。

研究思路及結果：研究工作建立了結合有機小分子標簽實際和常壓離子化質譜的超靈敏質譜免疫分析新方法。該方法中設計并合成了羅丹明系列的質譜標簽分子(Rhodamine-based Mass Tags， RMTs)。這種質譜標簽的結構可拓展性強，合成路線通用簡便。其結構中的剛性烷基聯和末端巰基確保了標簽分子在金納米粒子表面高效地自組裝和離子化過程中的高效解離及信號放大。在接下來的源內CID分析中，離子化過程中生成的羅丹明類似物經進一步碎裂形成穩定的特征碎片離子，完成信號的二次放大及目標物的準確定量，從而確保了分析的高靈敏度及準確性。該質譜免疫分析平臺以以氧化銦錫(ITO)玻璃芯片為主體。ITO芯片作為免疫識別和標記的固相基底，其表面能夠形成識別單元-目標物-標簽分子的“夾心”結構。該基底還參與質譜檢測過程中的電噴霧加速基底電噴霧離子化(Electrospray Accelerated Chip SprayIonization， eCSI)過程。該離子化過程中的物理解吸或化學裂解過程能高效解離質譜標簽分子。采用自動進樣軌道可實現樣品的快速、高通量多目標同時檢測。

利用該分析平臺，凝血酶加標樣品的LOD分別為10.9 zmol(PBS)和35.1 zmol(血清)。相比于凝血酶直接質譜檢測的0.4 pmol檢測限，靈敏度提高了107倍。該方法實現了2 μL血清中CA125等生物標志物的檢測，有望用于卵巢癌和乳腺癌的早期診斷。該平臺還可實現低至25個細胞水平的OVCAR-3和MCF-7細胞表面的重要三種生物標志物(CA125，CEA和EpCAM)的同時、原位表達差異測定，顯示了超高的靈敏度和多目標同時檢測能力，且具有普適性和可拓展性。該平臺能夠實現微升級臨床血樣及幾十個細胞水平樣品的簡便、快速、高靈敏且低成本的高通量篩查以及原位分析。

研究意義：該工作發展了膜蛋白生物標志物的超高靈敏度、高通量、多目標及操作簡便的超靈敏常壓質譜(AMS)免疫分析新方法。可實現微升級體液中zmol水平蛋白標志物的檢測以及幾十個細胞表面的疾病蛋白標志物的原位檢測。在臨床微量樣本中多目標物同時篩查和疾病診斷，以及單細胞層面的目標蛋白監控和定量研究領域具有重要意義。