UPLC/Q-TOF MS/MS負離子模式下環氧烷型環烯醚萜苷的結構表征

牟德華，胡高爽，李存滿

(1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北科技大學，河北省分析測試研究中心，河北 石家莊 050018)

環烯醚萜類化合物是一類分布廣泛的重要植物代謝產物，在自然界中一般以苷的形式存在，是許多中藥材及其制劑的主要有效成分，具有多種生物活性[1]。從分子結構角度看，環烯醚萜苷含有1個特征的結構骨架，即1個二氫吡喃環順式連接1個環戊烷類的單元結構，在C1位置上通常連接1個葡萄糖基。根據環烯醚萜苷基本骨架(母核)的結構，可將其分為環戊烯型、環戊烷型、環氧烷型和裂環環烯醚萜苷等同系組分[2]。

近年來，環烯醚萜苷的質譜裂解行為逐漸引起人們關注[3-6]，但關于環氧烷型環烯醚萜苷裂解途徑探討的文獻[7-8]較少，梓醇是一種研究較多的環氧烷型環烯醚萜苷。盧建秋等[7]利用高效液相色譜(HPLC)-離子阱質譜考察了梓醇在正負離子模式下的裂解途徑，發現在負離子模式下，只出現[2M-H]-峰，MS/MS分析只發現了取代基的斷裂，未發現其他特征性碎片離子；Nurahmat等[9]利用高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜(HPLC-Q-TOF MS/MS)技術對補腎益氣方的功能成分進行定性和定量分析，分離鑒定出3個環烯醚萜苷類化合物，其中包括梓醇，獲得的質譜碎片離子信息只涉及母環上取代基的斷裂；Tao等[10]利用UPLC/Q-TOF MS考察了梓醇在人類腸道菌群作用下的代謝產物，結果表明，正離子模式下代謝產物的質譜信息更豐富；Es-Safi等[8]利用高效液相色譜-三重四極桿質譜(HPLC-QQQ MS)考察了6個環烯醚萜苷(包括3個環氧烷型)的質譜裂解行為，由于四極桿質譜不能給出各化合物的精確質量數，因此，為了確定待測化合物的分子質量，實驗選擇正、負離子模式同時進行，3個環氧烷型環烯醚萜苷在負離子模式下的質譜信息相對較少，除了發現母環上取代基和葡萄基環的斷裂，未發現母環的斷裂；Li等[11]在超高效液相色譜-高分辨質譜負離子模式下，從猴面包樹果肉中鑒定出6個環烯醚萜苷，包括3個環氧烷型環烯醚萜苷，發現其裂解途徑除了母環上取代基的斷裂外，還存在母環上半縮醛結構的異構化而造成二氫吡喃環的開裂，這與本課題組考察的環戊烷型和環戊烯型環烯醚萜苷的裂解途徑相似[12]。目前，尚未發現針對環氧烷型同系組分的裂解行為進行系統性歸納與總結的報道。

本研究擬應用Q-TOF MS/MS對環氧烷型環烯醚萜苷同系組分(包括胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、胡麻屬苷和梓醇)在大氣壓化學電離源負離子(APCI-)模式下的質譜裂解行為進行系統性的探討和歸納，并利用UPLC/Q-TOF-MS/MS對胡黃連提取物中的環烯醚萜苷類化合物進行表征。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

LC-30A超高效液相色譜儀：日本島津公司產品；Triple TOF 5600+四極桿-飛行時間質譜聯用儀：美國AB Sciex公司產品，配有DouSpray離子源；數據采集軟件為AnaLyst?TF 1.6；數據處理軟件為Peakview 2.0。

1.2 主要材料與試劑

乙腈：色譜純，英國Fisher Scientific公司產品；甲酸：色譜純，美國TEDIA公司產品；梓醇、胡麻屬苷、胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ對照品：成都曼思特生物科技有限公司產品，其結構示于圖1；胡黃連：購自石家莊神威大藥房；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：InfinityLab Poroshall120 EC-C18柱(2.1 mm×150 mm×2.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；洗脫程序：0～20 min(5%～15%A)，20～35 min(15%～40%A)，35～40 min(40%A)；流速0.40 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。

1.3.2質譜條件 APCI離子源，霧化氣壓力345 kPa，輔助氣壓力345 kPa，氣簾氣壓力241 kPa，離子源溫度550.0 ℃，噴霧電壓5.5 keV，碰撞誘導電壓30 V，質量掃描范圍m/z50～1 000。

注：a.梓醇；b.胡黃連苷Ⅰ；c.胡麻屬苷；d.胡黃連苷Ⅱ圖1 環烯醚萜苷4種對照品的結構式Fig.1 Structures of 4 standards of iridoid glucosides

1.4 胡黃連提取物的制備

稱取約5.0 g粉碎后的胡黃連藥材粉末，利用快速溶劑萃取儀進行提取，提取溶劑為30%乙醇，提取時間5 min，提取溫度80 ℃，提取壓力10 342 kPa，提取2次。合并提取液，減壓濃縮至約5.0 mL，冷卻后用水定容至5.0 mL。取2.0 mL提取液上樣至預先平衡好的HPD722型大孔樹脂柱(10 cm×2 cm)中，靜態吸附約15 min，再依次用30 mL水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇依次洗脫并收集洗脫液。實驗結果表明，環烯醚萜苷主要集中于30%乙醇洗脫液中，因此將該部分作為本實驗的分析對象。

1.5 離子命名

環烯醚萜苷骨架斷裂產生的診斷性碎片離子的命名沿用本課題組之前對環烯醚萜苷裂解碎片離子的離子命名法進行[12]。其中，i,jF代表從苷元裂解產生的碎片離子，i和j分別表示基本骨架的環上各鍵之間的斷裂；k,lAj、k,lBj、k,lCj代表糖苷部分產生的碎片離子，j是指從苷元處算起，糖苷內部鍵斷裂的數目，k和l是指單糖內部環在不同鍵之間斷裂的情況；Yj和Zj代表包括苷元在內的碎片離子。環烯醚萜苷斷裂途徑命名示意圖示于圖2。

2 結果與討論

2.1 在負離子模式下，環氧烷型環烯醚萜苷對照品的MS分析

在APCI負離子模式下，考察4個環氧烷型環烯醚萜苷對照品的裂解途徑。在一級質譜圖中，均檢測到加合離子[M+HCOO]-以及準分子離子[M-H]-，這與環戊烷型和環戊烯型環烯醚萜苷在流動相加入0.1%甲酸添加劑時的一級MS信息有所不同，對后者而言，只有當C4位為甲酯基或內酯時，該環烯醚萜苷才會出現[M+HCOO]-加合離子[12]。

2.2 在負離子模式下，環氧烷型環烯醚萜苷對照品的MS/MS分析

為進一步探究環氧烷型環烯醚萜苷在負離子模式下的裂解行為，分別以2.1節中4個對照品的[M-H]-為母離子，進行MS/MS分析。根據所生成碎片離子的特點，將上述4個對照品分為2組：第1組包括胡黃連苷Ⅰ和梓醇；第2組包括胡黃連苷Ⅱ和胡麻屬苷。

圖2 以梓醇為例，環烯醚萜苷在APCI負離子模式下的離子命名示意圖Fig.2 Taking catalpol for example, ion nomenclature adopted for fragmentation of iridoid glucoside in APCI- mode

第1組中的胡黃連苷Ⅰ和梓醇的分子結構中苷元部分相同，C6和C8位均有相同的取代基，只是糖基部分不同，示于圖1。因此，這2個對照品的質譜裂解途徑相似，二者的一級、二級質譜圖和梓醇的裂解途徑示于圖3。根據碎片離子的精確質量數可獲得其元素組成，以排除一些碎片離子在定性上的不確定性。由圖3e可見，梓醇母環上的取代基斷裂丟失葡萄糖基單元，產生m/z199.1[M-H-Glc]-碎片離子，繼而丟失1分子H2O和1分子CH2O，生成m/z181.1[M-H-Glc-H2O]-和m/z169.1[M-H-Glc-CH2O]-。同時，發現環烯醚萜苷特征性的母核環上的半縮醛結構異構化，造成二氫吡喃環的斷裂，產生碎片離子1,4F-(m/z137.0，127.0)，這與環戊烷型和環戊烯型環烯醚萜苷的斷裂途徑相似[12]。

第2組中胡黃連苷Ⅱ和胡麻屬苷的一級、二級質譜圖示于圖4a～4d，胡麻屬苷的裂解途徑示于圖4e。該組對照品的質譜裂解途徑與第1組存在差異，推測其主要原因是第2組對照品的苷元取代基的空間結構較大。由圖4e可見，胡麻屬苷存在常見的中性丟失，生成m/z401.1[M-H-H2O]-或葡萄糖基m/z257.1[M-H-Glc]-等。另外，還會發生母環半縮醛結構的異構化，形成2個醛基取代基，丟失1分子CO，生成m/z193.0碎片離子，還存在母環結構中C1和C6的斷裂,生成1,6F-離子(m/z159.0)，進而依次失去1分子CO和1分子H2O而產生m/z131.0和m/z113.0碎片離子。

圖3 在APCI-模式下，胡黃連苷Ⅰ的Q-TOF MS圖(a)和MS/MS圖(b)，梓醇的MS圖(c)、MS/MS圖(d)及其裂解途徑示意圖(e)Fig.3 Q-TOF MS spectrum (a) and MS/MS spectrum (b) of picroside Ⅰ, MS (c), MS/MS (d) and the fragmentation pathway (e) of catalpol in APCI- mode

圖4 在APCI-模式下，胡黃連苷Ⅱ的Q-TOF MS圖(a)和MS/MS圖(b)，胡麻屬苷的MS圖(c)、MS/MS圖(d)及其裂解途徑示意圖(e)Fig.4 Q-TOF MS spectrum (a) and MS/MS spectrum (b) of picroside Ⅱ, MS (c), MS/MS (d) and the fragmentation pathway (e) of sesamoside in APCI- mode

綜上所述，在APCI-模式下，環氧烷型環烯醚萜苷主要的質譜裂解途徑不僅包括常見的母環上取代基的斷裂，如丟失H2O、CO2和葡萄糖基等；還有該類同系組分特征的母環斷裂，生成1,4F-、1,6F-等特征碎片離子。這是由于環烯醚萜苷骨架上存在1個二氫吡喃環，這種半縮醛結構趨向于異構化，形成2個醛基取代基，從而造成二氫吡喃環的斷裂，生成1,4F-離子；而1,6F-碎片離子的生成與環戊烷型及環戊烯型環烯醚萜苷斷裂生成2,6F-和2,7F-離子[12]的規律不同，可能是由于該類同系組分結構中存在環氧烷造成的。同時，該類同系組分還存在葡萄糖基環的斷裂，生成0,4A1-、1,4A1-及2,4A1-等碎片離子。在APCI+模式下，環氧烷型環烯醚萜苷一級質譜中主要出現準分子離子[M+H]+以及加合離子峰[M+Na]+、[M+H2O]+、[M+K]+等；二級質譜中，除了失去葡萄糖基、H2O或CH3OH等，特征性碎片離子相對較少(另文發表)。環氧烷型環烯醚萜苷在APCI-模式下的MS/MS碎片離子信息較APCI+模式豐富，碎片離子特征性更強。

2.3 胡黃連提取物的MS及MS/MS分析

圖5 負離子模式下，胡黃連提取物的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of extract of Picrorhiza scrophulariiflora Pennell in APCI- mode

利用UPLC/Q-TOF MS和MS/MS對胡黃連提取物中環烯醚萜類化合物進行表征。該提取物在負離子模式下的總離子流圖示于圖5。從胡黃連提取物中共鑒定出10個環烯醚萜苷，其主要的質譜信息列于表1。通過比對峰6、8與對照品的保留時間(tR)以及質譜信息，確定二者分別為胡黃連苷Ⅱ和胡黃連苷Ⅰ；推測另外8個化合物依次為Boschnaloside、Mussaenosidic acid、梓苷、Piscroside B、胡黃連苷Ⅲ、黃金樹苷、胡黃連苷Ⅳ、婆婆納苷，它們二級質譜圖及分子結構式示于圖6。

峰1的準分子離子[M-H]-為m/z343.104 2[C16H23O8]-。在[M-H]-的二級質譜中，出現碎片離子C0-(m/z179.1)、0,4A1-(m/z119.0)、1,4A1-(m/z89.0)和2,4A1-(m/z59.0)，表明峰1化合物的苷元部分連接1個葡萄糖基團[12]。碎片離子m/z181.1[M-H-Glc]-對應苷元部分，2,7F0-(m/z85.0)和2,6F0-(m/z101.0)特征離子的出現[12]表明該化合物為環戊烷型環烯醚萜苷。因此，推測峰1為Boschnaoside，該化合物曾在胡黃連中發現[13]。

在峰2的一級質譜圖中，只發現準分子離子峰[M-H]-(m/z375.128 8,C16H23O10)。以[M-H]-為母離子，在其二級質譜圖中，碎片離子m/z213.1是由中性丟失1分子葡萄糖基([M-H-Glc]-)生成的，基峰碎片離子m/z169.1對應[M-H-Glc-CO2]-，表明苷元部分含有1個羧基取代基。另外，還出現1,4F-(m/z125.1)和2,7F0-(m/z101.0)特征離子，表明C8位可能連接1個CH2OH或1個OH和1個CH3。由于碎片離子m/z107.0可能是由1,4F-(m/z125.1)進一步丟失1分子H2O生成的，因此，C8位可能連接1個OH和1個CH3。碎片離子m/z113.0是2,7F-特征離子，由此推測C6位無取代基。綜上，推測峰2為Mussaenosidic acid，該化合物曾于胡黃連中發現[13]。在峰2化合物的一級質譜圖中未發現加合分子離子[M+HCOO]-，這與文獻[12]報道的當C4位取代基不是甲酯基或內酯時，該環烯醚萜苷只形成[M-H]-，而不形成加合離子的結論一致。

峰3的一級質譜圖中同時出現準分子離子[M-H]-(m/z481.137 6,C22H25O12)和加合離子峰[M+HCOO]-(m/z527.167 6,C23H27O14)，因此，較容易確定該化合物的分子質量及分子式。以[M-H]-為母離子的MS/MS圖中，碎片離子m/z319.1是由母環上丟失1分子葡萄糖基生成，基峰碎片離子m/z205.1是環氧烷型環烯醚萜C1和C6斷裂產生的1,6F-特征離子，碎片離子m/z137.0是丟失苷元上的對羥基苯甲酸(p-HBA)生成。因此，推測峰3為梓苷，該化合物也曾在胡黃連中發現[13]。

在峰4的一級質譜圖中，出現準分子離子m/z507.2([M-H]-)、加合分子離子峰m/z553.154 1([M+HCOO]-)和二聚體分子離子峰m/z1 015.3([2M-H]-)，依據精確分子質量確定峰4分子式為C24H28O12，分子質量為508.2。

表1 UPLC/Q-TOF MS檢測到的胡黃連提取物中的環烯醚萜苷信息Table 1 Information of IGs detected by UPLC/Q-TOF MS from the extract of P. scrophulariiflora Pennell

圖6 峰1(a)，2(b)，3(c)，4(d)，5(e)，7(f)，9(g)，10(h)的準分子離子峰[M-H]-二級質譜圖及化合物結構式Fig.6 MS/MS spectra of the [M-H]- ions of peak 1(a), 2(b), 3(c), 4(d), 5(e), 7(f), 9(g), 10(h) and their structures

以[M-H]-(m/z507.2)為母離子的MS/MS圖中，碎片離子m/z307.1是由母環丟失1分子葡萄糖基(葡萄糖基上帶有1分子肉桂酸基團)生成的，碎片離子m/z163.0是糖基上丟失的1分子對羥基肉桂酸(p-HCA)取代基；m/z145.0可能是由p-HCA繼續丟失1分子H2O生成的。綜上，推測峰4為環氧烷型環烯醚萜苷Piscroside B，該化合物曾在胡黃連中發現[13-14]。

在峰5的一級質譜圖中，出現準分子離子[M-H]-(m/z537.163 6,C25H29O13)和[M+HCOO]-(m/z583.164 9,C26H31O15)。在[M-H]-的MS/MS圖中，碎片離子m/z337.1是葡萄糖基(葡萄糖基上帶有1分子阿魏酸基團FA)，碎片離子m/z193.1、175.0和160.0分別是[FA-H]-、[FA-H-H2O]-和[FA-H-H2O-CH3]-。因此，推測峰5為胡黃連苷Ⅲ。

峰7的準分子離子為[M-H]-(m/z507.153 4,C24H27O12)，據此推測其與峰4互為同分異構體。在MS/MS圖中，碎片離子m/z345.1是苷元丟失1分子葡萄糖基而產生的，基峰碎片離子m/z231.1是環氧烷型環烯醚萜苷特征離子1,6F-。此外，碎片離子m/z163.0的存在進一步確認峰7化合物含有1對羥基肉桂酸取代基。峰7的質譜裂解碎片信息與化合物黃金樹苷一致，該化合物曾在胡黃連中發現[13-14]，因此，推測峰7為黃金樹苷。

峰9的準分子離子為[M-H]-(m/z537.163 5,C25H29O13)，與峰5互為同分異構體。基峰碎片離子m/z261.077 1對應1,6F-特征離子，碎片離子m/z375.1是由母離子丟失苷元連接的葡萄糖基生成的；m/z193.1表明苷元上連接有1個阿魏酸(FA)取代基。因此，推測峰9為胡黃連苷Ⅳ。

峰10的保留時間為32.7 min。在一級質譜圖中，出現準分子離子峰[M-H]-(m/z465.130 36，C22H25O11)和加合分子離子峰[M+HCOO]-(基峰，m/z511.145 9，C23H27O13)，表明該化合物的分子質量為466.1。以[M-H]-(m/z465.130 3)為母離子進行MS/MS分析，出現碎片離子m/z303.1，推測該化合物失去1個葡萄糖基，繼而失去1分子苯甲酸，生成碎片離子m/z181.1([M-H-Glc-C6H5COOH]-)；碎片離子m/z121.0對應苯甲酸基[C6H5COO]-。作為基峰的碎片離子m/z189.1，對應環氧烷型環烯醚萜苷的特征離子1,6F-。因此，推測峰10為已在胡黃連中發現的環氧烷型環烯醚萜苷婆婆納苷[13-14]。

3 結論

本研究利用Q-TOF MS/MS系統考察了4種環氧烷型環烯醚萜苷同系組分的質譜裂解規律。在APCI-模式下，環氧烷型環烯醚萜苷主要的質譜裂解途徑除了常見的母環上取代基的斷裂外(如丟失H2O、CO2和葡萄糖基等)，還有該類同系組分特征的母環斷裂，生成1,4F-、1,6F-等特征碎片離子。同時，該類同系組分還存在葡萄糖基環的斷裂，生成0,4A1-、1,4A1-和2,4A1-等碎片離子。在此基礎上，利用UPLC/Q-TOF MS/MS對胡黃連提取物中的環烯醚萜苷類化合物進行表征，結合本課題組先前的工作[12]，共鑒定出10個環烯醚萜苷。實驗結果表明，在APCI-模式下，環烯醚萜苷的質譜裂解途徑與ESI-模式下的裂解途徑相似，沒有明顯差異。該研究有助于推動胡黃連在物質基礎表征、質量控制和臨床應用上的開發和利用。