質譜鳥槍法非靶向快速初篩青魚中微囊藻毒素殘留

崔益瑋，林亞楠，李詩言，戴志遠,3，王 揚，沈 清,3

(1.浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310023；3.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江 杭州 310012)

青魚(Mylopharyngodonpiceus)又稱黑鯇、烏鯖，是長江中下游和沿江湖泊的重要漁業資源[1]，具有肉質細嫩、味道鮮美、飼料系數低、生長速度快等諸多特點，一直深受廣大消費者的青睞[2]。近年來，由于環境、飼料等因素導致的青魚病害問題不斷發生，尤其是水體富營養化污染容易急性大范圍暴發，造成青魚大規模死亡，帶來巨大的經濟損失。

微囊藻毒素(microcystins, MCs)是一類由水體富營養化引起的藍藻水華產生的肝臟毒素，具有較大的毒害性[3]。MCs具有單環七肽分子結構，為環-(D-丙氨酸-L-R1-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-R2-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸)，其中R1和R2在不同的MC異構體中代表不同的L-氨基酸，并以此命名該毒素[4]。MCs異構體種類多，且性質穩定，煮沸后不失活，耐酸堿變化。MCs進入肝細胞后，甲基脫氫丙氨酸(methyldehydroalanine, Mdha)的不飽和羧基可與C亞基活性位點的半胱氨酸的巰基共價連接形成蛋白加合物，從而抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A, PP2A)的活性[5]。其中，微囊藻毒素LR(MC-LR)是公認的肝毒素和促癌劑，目前已知的生理毒性僅次于二噁英[6]。MCs主要通過飲用水和被污染的水產品(魚蝦、軟體動物及藻類制品等)進入人體，嚴重威脅人類健康，世界衛生組織設定臨時可耐受的每日攝取量為0.04 μg/(kg·d)[7]。

MCs常用的檢測手段主要包括小鼠腹腔注射生物分析法、化學分析法、酶聯免疫法、蛋白磷酸酶抑制法等[8-10]。Kaya等[11]將MCs氧化生成2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸(MMPB)，經甲酯化衍生后用氣相色譜-質譜(GC/MS)測定MCs總含量。郭堅等[12]采用固相萃取-液相色譜/紫外檢測法(SPE-HPLC/DAD)測定水體、土壤等樣品中的MCs。近年來，因液相色譜-串聯質譜技術(HPLC-MS/MS)既可以準確定量，又能夠提供化合物的結構信息，被廣泛用于食品中獸藥殘留等污染物的檢測分析[13-15]。但上述方法普遍存在操作復雜，且無法實現不同種類MCs分析鑒定等缺點。“鳥槍法”是在電噴霧電離質譜技術基礎上改進后，利用源內分離原理，創立的無需色譜分離就可直接分析的質譜技術。這不僅可以避免液相色譜法中經常存在的樣品殘留問題，還簡化了操作步驟，且能夠同時檢測多種MCs。

本研究針對MCs的分子結構特征，通過優化前處理及檢測條件，以MCs的共有特征官能團為線索，擬建立一種基于串聯質譜技術的鳥槍法非靶向快速篩查青魚中MCs，希望為開展青魚中MCs污染研究提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

1200高效液相色譜系統：美國Agilent公司產品；4000Qtrap串聯飛行時間質譜儀：美國AB Sciex公司產品，配有Harvard Pump11恒流注射泵、電噴霧離子源(ESI)及Analyst1.5數據處理系統；高速冷凍離心機：美國Thermo Scientific公司產品；MDF-382E超低溫冰箱：日本Sanyo公司產品；Milliplus 2150超純水處理系統：美國Millipore公司產品。

1.2 材料與試劑

鮮活青魚樣品：購自杭州本地市場，經鑒定為青魚(Mylopharyngodonpiceus)；微囊藻毒素RR(MC-RR)、YR(MC-YR)、LR(MC-LR)、LA(MC-LA)、LF(MC-LF)、LY(MC-LY)及LW(MC-LW)標準品(純度>95.0%)：中國臺灣Algal Science公司產品；Oasis HLB固相萃取柱：美國Waters公司產品；甲醇、乙腈和甲酸：均為色譜純，德國Merck公司產品；純凈水：由Milli-Q超純水處理系統制得；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗條件

1.3.1樣品處理 新鮮青魚經去鱗、去頭、去內臟后取背部和胸部肌肉，切成小塊，剔除明顯骨刺；組織肌肉經斬拌成魚糜后，置于4 ℃冰箱冷藏，備用。

各取0.01 g MCs標準品，甲醇溶解，定容至10 mL棕色容量瓶，制得1.0 g/L的MCs標準品溶液，于4～6 ℃冷藏，備用。

1.3.2MCs提取 取1 g青魚肌肉組織肉糜于15 mL離心管中，加入5 mL乙醇-水-甲酸萃取液(90∶9.9∶0.1，V/V/V)，劇烈振蕩20 min，隨后用探頭式超聲(25 kHz，60%變幅)輔助提取10 min，混合物在4 ℃下以8 000 r/min冷凍離心15 min。用移液槍轉移離心管中上清液至新移液管，并繼續向沉淀中加入5 mL萃取液，重復上述操作，提取2次。合并3次提取的上清液，氮氣吹干，用甲醇-水溶液(90∶10，V/V)復溶至1 mL。

依次用6 mL甲醇和水活化Oasis HLB固相萃取柱。萃取液均勻上樣，并依次用6 mL超純水和乙醇-水淋洗液(5∶95，V/V)淋洗，棄去淋洗液，用5 mL純甲醇洗脫吸附在HLB柱上的MCs，控制流速約為1滴/秒，收集洗脫液。氮氣吹干，用甲醇復溶至1 mL，過0.22 μm有機濾膜，待質譜分析。

1.3.3質譜條件 注射泵進樣流速10 μL/min；質量掃描范圍m/z400～1 200；電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；Q1全掃描和母離子掃描(precursor ion scan, PreIS)模式，特征碎片離子m/z135.2；噴霧電壓5.5 kV；干燥溫度550 ℃；源內碰撞誘導解離氣為氮氣。具體質譜參數列于表1。

1.3.4數據處理和統計分析 采用Analyst QS v2.0軟件進行數據采集與分析，用Excel對MCs提取中6組平行數據進行標準差分析，并用Origin軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 固相萃取優化

由于青魚組織樣品的基質較復雜，選取合適填料的固相萃取柱對降低基質效應和提高MCs回收率至關重要。實驗比較了Florisil柱(10 mm×1 mm)、HLB柱(10 mm×1 mm)和C18柱(10 mm×1 mm)的富集、凈化效果，結果示于圖1。由圖可見，HLB對MCs的回收率最高(68.2%～83.4%)，其次為C18(63.5%～78.5%)，而Florisil對MCs的固相萃取效果不佳，回收率僅為60%左右。HLB柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合而成的大孔共聚物，對極性污染物的富集效率高，且具有相對較高的容量因子[16]。考慮到樣品中MC種類多且復雜，實驗選用HLB固相萃取柱富集凈化樣品中MCs。

表1 5種MCs質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of MC species

圖1 不同固相萃取填料對MCs回收率的影響Fig.1 Effect of sorbent types on the recovery of MCs

青魚組織樣品基質較復雜，在洗脫MCs前有必要對SPE柱進行淋洗，通常是在淋洗液中加入一定比例的甲醇或乙腈以去除色素等干擾物質，但會造成目標化合物一定程度的損失。本實驗分別用2%、5%、10%和15%的甲醇-水溶液淋洗SPE固定相。結果發現，5%甲醇會造成MCs流失，且流失程度隨甲醇比例的提高而增加，因此選用2%甲醇-水溶液作為淋洗液。本實驗還考察了80%、90%和純甲醇作為洗脫液的洗脫效果。實驗發現，80%甲醇作為洗脫液時，MCs回收率較低，無法將吸附在HLB填料上的MCs解吸完全；而用純甲醇作為洗脫液時，會同時洗脫一些雜質，造成質譜峰干擾。因此，選用90%甲醇作為洗脫液。

2.2 質譜條件的優化

將MCs母液稀釋100倍得到10 mg/L的工作液，通過直接進樣的方式優化母離子和子離子參數。由于MC是一類環肽化合物，且ESI離子源是一種軟電離方式，因此MCs會同時形成+1價、+2價離子以及其他鈉、鉀等加合離子。在Q1全掃描模式下，化合物質譜峰主要集中在低分子質量段(m/z450～550)，MCs母離子以雙電荷母離子[M+2H]2+為主，其中信號響應最強的為m/z520.3([RR+2H]2+)，其次為m/z523.8([YR+2H]2+)。將高分子質量段窗口放大后，可觀察到MCs的單電荷母離子，如m/z996.1([LR+H]+)、m/z1 024.9([LW+H]+)以及m/z1 046.0([YR+H]+)等，但其信號響應強度比雙電荷母離子小2個數量級，示于圖2。因此，本實驗選取雙電荷母離子[M+2H]2+為主要研究對象。

在子離子掃描(product-ion scan, PIS)模式下分析各個MC的裂解規律與碎片特征。以MC-RR為例，選取m/z520.3([RR+2H]2+)為母離子進行碰撞誘導解離，通過編輯Ramp觀察碰撞電壓(CE)動態變化過程中的碎片特征。結果發現，在不同CE下，MC-RR的典型碎片峰包括m/z375、213和135等，其中m/z135為MC的共有基團Adda的甲氧鍵斷裂形成的特征碎片峰([C9H11O+H]+)，示于圖3a；m/z213是基團D-Glu斷裂形成的特征碎片峰([C9H14O4N2+H]+)；m/z375為([C11H15O+Glu+Mdha+H]+)。這3種離子為大部分MC共有結構的特征碎片，本實驗所檢測的5種MCs子離子譜圖中均產生這3種特征碎片峰。通過優化CE能量，在各個碎片峰最優能量下，m/z135信號強度最大，達3.5×107。因此，本實驗選擇m/z135為MCs的特征碎片進行PreIS掃描。

圖2 Q1全掃描模式下，MCs的質譜圖Fig.2 Mass spectrum of MCs under Q1 full scan

圖3 MC-RR的二級質譜圖(a)和以m/z 135.2為特征碎片的母離子掃描圖(b)Fig.3 MS2 mass spectrum of MC-RR (a) and precursor ion scan of m/z 135.2 (b)

使用MC-RR標準工作液直接進樣，以m/z135為特征碎片進行PreIS掃描，示于圖3b。可見，質譜圖較為純凈，m/z520.2[RR+2H]2+為信號響應最強峰，除此之外，也可觀察到少量的m/z531.3[RR+H+Na]2+和m/z542.2[RR+2Na]2+；在m/z1 039.0處未檢測到單電荷離子峰[RR+H]+。MC-YR、MC-LR、MC-LF和MC-LW的質譜碎裂特征與RR相似。使用5種MCs混合標準工作液直接進樣后的結果示于圖4。雖然進樣濃度相同，但是各個MC的離子化效率不同，導致信號響應強度差異較大，MC-YR和MC-LR較容易離子化，因此離子峰強度相對較高，達到了2.5×105，而MC-RR、MC-LF和MC-LW信號相對較弱。該結果進一步驗證了MCs離子化后更傾向于生成雙電荷離子，以m/z135為特征碎片離子的PreIS掃描幾乎不產生單電荷[MCs+H]+。

圖4 母離子掃描模式下5種MCs質譜圖Fig.4 Mass spectrum of MC species using precursor ion scan mode

2.3 基質對方法線性的影響

MCs鳥槍法沒有將樣品經色譜分離即直接進樣，因此混合物成分較復雜。基質效應主要來自兩方面：1) 樣品中的雜質分子會對MCs的離子化產生干擾；2) 不同種類MCs之間存在離子化競爭效應，會影響信號的強度和穩定性[17]。通常以基質對目標化合物回收率的增強和減弱效應評價基質效應的影響。本實驗采用實際樣品基質加入混合標準品的方法同時建立5種MCs標準曲線，通過標準曲線的線性關系間接反映基質效應的影響，結果列于表2。可見，在線性范圍內，各個MC的相關系數R2介于0.992 5～0.997 1之間，各個數據點的基質效應在擬合標準曲線的過程中部分抵消，線性關系良好，能夠滿足一般分析測試需求。

2.4 方法學驗證

采用標準添加法測定方法靈敏度，根據3倍和10倍信噪比(S/N)確定MCs的方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結果列于表2。可知，該方法的靈敏度較高，檢出限和定量限分別不大于 1.25 μg/L和3.99 μg/L，能夠滿足MCs高靈敏度檢測的要求。在空白青魚樣品中添加MCs標準品工作溶液，制成100、200 μg/L的加標樣品，按1.3節方法進行精密度和回收率實驗，每個添加水平做6次平行測定，結果列于表3。可知，MCs的日內精密度和日間精密度的相對標準偏差分別為6.8%～8.6%和7.2%～9.1%，說明該方法的重現性較好；回收率為68.2%～83.4%，RSD為4.5%～6.8%，能夠滿足一般分析測試的要求。

表2 鳥槍法非靶向快速篩查MCs的線性和靈敏度Table 2 Linearity and sensitivity of shotgun untargeted screening of MCs using mass spectrometry

表3 鳥槍法非靶向快速篩查MCs的靈敏度、精密度和回收率Table 3 Sensitivity, accuracy and recovery of shotgun untargeted screening of MCs using mass spectrometry

2.5 樣品檢測

為了解市場上青魚中MCs污染情況，采用建立的質譜鳥槍法快速初篩市售20個青魚樣品，并對結果進行數理統計分析。結果發現，20個青魚樣品中，共計3個樣品檢出MCs為陽性，檢出率為15%，主要檢出的MCs種類為MC-RR和MC-LR，MCs總濃度為3.4～15.8 μg/kg，其余樣品均未檢出MCs。青魚喜好以螺螄等貝類為食，而螺螄常以泥土中的微生物和腐殖質、水中浮游植物、幼嫩水生植物、青苔等為食，因此MCs較容易通過食物鏈富集到青魚體內。

3 結論

本研究建立了一種鳥槍法非靶向快速篩查青魚中MCs殘留。該方法在準確度、回收率等方面略遜于常規的LC-MS/MS MRM模式，但鳥槍法的檢測速度極快，可靠性和線性基本滿足要求，尤其適合在待檢樣品數量巨大的情況下快速初步篩查MCs陽性樣品，然后通過HPLC-MS/MS對陽性樣品進行準確定量，可顯著提高工作效率，提高檢測通量。