超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜快速篩查魚和蝦樣品中200種藥物殘留

于慧娟，汪 洋,2，孔 聰，婁曉祎，韓 峰，王 媛，湯云瑜

(1.東海水產研究所，農業部水產品風險評估實驗室(上海)，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306)

水產品中的藥物殘留主要來源于養殖過程中漁藥和飼料的使用。目前，存在向漁藥和飼料中非法添加藥物的現象，質量良莠不齊[1-3]。將質量不合格的漁藥、飼料用于水產動物養殖過程，會導致水產品中的藥物殘留呈現雜亂未知狀態，難以預測其中的安全隱患。因此，建立高效可靠的水產品中多種藥物同時快速篩查的方法，對水產品中藥物殘留風險監測和隱患排查具有十分重要的意義。

目前，食品中藥物殘留的檢測方法主要為液相色譜-三重四極桿串聯質譜法[4-6]，并通過多反應監測模式或選擇反應監測模式實現多種化合物的同時定性與定量[7-8]。由于三重四極桿質譜儀的分辨率和質量精度較低，該方法局限于檢測結構類似的同族化合物或少數其他幾類化合物[9-10]。

隨著獸藥的商業化，越來越多的化合物種類需要監測[11]。高分辨質譜憑借高分辨率和高質量精度為多殘留檢測提供了新的手段，例如飛行時間質譜[12-14]和靜電場軌道阱質譜[15-21]，這些技術不僅能同時分析上百種化合物，還可以進行非目標物的篩查。采用液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法快速篩查水產品中藥物殘留是近幾年新興的一種檢測手段，相關研究報道較少。楊璐齊等[20]和Sherri等[21]運用此技術分別同時檢測了水產品中33種、260種藥物，雖然Sherri等測定了260種藥物，但經實際樣品驗證的藥物僅為70多種。

本研究擬建立超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質譜法，通過優化分析條件，開發快速、高通量的樣品前處理方法，實現水產品中200種藥物殘留的同時快速檢測，并通過建立化合物數據庫對目標物進行定性。希望為快速了解水產品中藥物殘留狀況、隱患因子排查提供有效的技術支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Ultimate 3000 超高效液相色譜-Q-Exactive靜電場軌道阱高分辨質譜聯用系統：配有TraceFinder分析軟件，美國Thermo Fisher公司產品；0.22 μm尼龍水相針式濾膜：美國Supelco公司產品；渦旋攪拌器：德國IKA公司產品；16RXII高速冷凍離心機：日本 HITACHI CF公司產品；Milli-Q超純水機：美國Millipore公司產品；PL602-L電子天平：瑞士Mettler-Toledo公司產品；BT 125D精密天平：德國Sartorius公司產品；KQ-300E超聲波提取儀：昆山市超聲儀器有限公司產品。

1.2 主要材料與試劑

200種風險排查標準品：均為德國Dr. Ehrenstofer GmbH公司產品；乙腈、甲醇、乙酸乙酯和甲酸：均為色譜純，美國J.T.Baker公司產品；實驗用水：由Milli-Q超純水機制備；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/3 mL)：美國Waters公司產品。

1.3 實驗條件

1.3.1樣品制備 從農貿市場購買草魚、鯽魚、鳊魚和南美白對蝦等鮮活水產品。取魚可食用部分，均質混勻；將蝦去頭、去殼，均質混勻；分別裝入聚乙烯瓶中，于-18 ℃冷凍保存，測定前解凍，稱樣。

1.3.2樣品前處理 準確稱取2.00 g樣品于30 mL聚丙烯離心管中，加入200 μL 0.1 mol/L EDTA-Na2和10 mL乙腈，在高通量研磨儀中，以2 000 r/min振蕩30 s，超聲10 min，渦旋2 min，于5 ℃以10 000 r/min離心10 min，取出上清液。向殘渣中加入10 mL乙酸乙酯，按上述方法重復操作1次，合并2次上清液，于40 ℃減壓蒸發至近干，用3 mL乙腈溶解，以6 000 r/min離心10 min，得到待凈化液。

將待凈化液加入SPE固相萃取柱中，用1 mL乙腈淋洗，接收全部上樣流出液至10 mL離心管中，40 ℃氮氣吹至近干，用1 mL含0.1%甲酸的乙腈-水溶液(40∶60，V/V)復溶，于5 ℃以10 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm尼龍針式濾膜，待測。

1.3.3色譜條件 色譜柱：Thermo Accuore aQ柱(100 mm×2.1 mm×2.6 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸-乙腈溶液(B)；梯度洗脫程序：0～1.0 min(100%A)，1.0～18.0 min(100%～0%A)，18.0～22.0 min(100%A)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.4質譜條件 靜電場軌道阱質譜；可加熱的電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)；噴霧電壓：3.2 kV(+)，2.8 kV(-)；鞘氣：氮氣，流速8 L/min；輔助氣：氮氣，流速10 L/min，溫度350 ℃；吹掃氣：氮氣，流速1.5 L/min；離子傳輸管溫度：325 ℃；質譜數據獲取模式：一級母離子全掃描加數據依賴的二級子離子掃描模式(Full MS/dd-MS2)；Full MS分辨率：70 000；最大注入時間：100 ms；質量掃描范圍：m/z150～1 000；二級質譜分辨率：17 500；觸發閾值：2×105；最大注入時間80 ms。200種藥物的質譜參數列于表1。

1.3.5標準溶液的配制 準確稱取適量的標準品，用甲醇配制成約500 mg/L的單標儲備液，不溶藥品加入1 mL甲酸或二甲亞砜溶解后，用甲醇定容，于-42 ℃避光保存。將200種藥物按性質分為18類，即苯并咪唑類、β-受體激動劑類、β-內酰胺類、氯霉素類、染料類、激素類、大環內酯類、硝基呋喃類、喹諾酮類、喹噁啉類、鎮靜劑類、磺胺類、三嗪類、四環素類、硝唑類、咪唑類農藥、有機氯類農藥和有機磷類農藥，分別吸取適量的單標儲備液，用甲醇配制成18種10 mg/L混合標準溶液；再分別吸取適量的18種混合標準溶液，用甲醇稀釋，配制成濃度均為0.5 mg/L的200種藥物混合標準工作液，于-42 ℃避光保存。

表1 200種化合物的色譜、質譜信息和檢出限Table 1 Chromatographic and mass spectrometric parameters of 200 compounds

續表1

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1.3.6數據庫、定性和定量分析 收集200種藥物的分子式和相對分子質量信息，在優化的液相色譜和質譜條件下，獲取0.1 mg/L各類藥物的色譜保留時間、母離子及加合模式，并在梯度碰撞能量(20、50、80 eV)下獲得碎片離子信息。利用TraceFinder軟件建立含有化合物名稱、CAS號、分子式、精確分子質量、保留時間、母離子質荷比(精確至10-5)以及碎片離子質荷比的數據庫。

利用Full MS/dd-MS2模式采集數據，結合建立的數據庫進行定性篩查，確認檢出的標準為：母離子質荷比偏差<3×10-6；保留時間偏差<15 s；同位素質荷比偏差<10×10-6、相對豐度偏差<25%、綜合比對>75%；碎片離子質荷比偏差<20×10-6，且至少有1個碎片離子滿足此要求。采用基質匹配標準曲線外標法，利用母離子進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優化

本實驗的200種目標物極性差異較大，采用乙腈、乙酸乙酯為提取劑，對草魚加標樣品進行提取實驗。結果表明，乙腈作為提取劑時，多數藥物能被提取出來，但激素類、鎮靜劑類和咪唑類藥物的提取效率較低；乙酸乙酯作為提取劑時，雖然能夠提高激素類和鎮靜劑類藥物的提取效率，但沙星類、β-激動劑類和染料類藥物的提取效率較低。為實現不同極性化合物均可達到高效率提取，本實驗采用兩步提取的方法，即先用乙腈超聲提取，再用乙酸乙酯對殘渣超聲提取，經兩次提取，檢測回收率為30%～120%，其中，有75%藥物的回收率大于50%。

2.2 色譜條件的優化

本實驗涉及的目標物種類繁多、性質各異，為達到所有目標物同時分析、準確定性的目的，選擇Thermo AccucoreaQ柱作為色譜柱，對200種目標物進行分離實驗。結果顯示，非極性、弱極性和極性化合物在該色譜柱上的保留性能良好，極性化合物的保留性能優于Thermo Accucore C18 色譜柱。以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液為流動相，優化的梯度洗脫條件見1.3.3節，在最佳色譜分離條件下，各藥物均得到有效保留，峰形和靈敏度良好。在22 min內，通過1次進樣可實現200種藥物的快速篩查分析。200種藥物的保留時間已列于表1，部分同分異構體和極性化合物的提取離子流圖示于圖1。

2.3 質譜條件的優化

根據200種藥物的電離性質，選用ESI+和ESI-離子化模式，其中，甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素、玉米赤霉醇、卡拉珠利、地克珠利、頭孢呋辛和丫啶黃在負離子模式下響應；其余藥物均在正離子模式下響應。采用流動注射方式對200種藥物分類進行一級質譜全掃描，質量掃描范圍m/z150～1 000，選擇信號最強的目標離子作為一級母離子。200種藥物母離子、子離子及掃描模式列于表1。

2.4 線性范圍和檢出限

以魚、蝦空白基質溶液配制基質匹配工作曲線進行定量分析，以消除基質效應對測定結果的影響。基質標準曲線的繪制方法為：以空白基質液配制1～1 000 mg/L系列混合標準溶液，檢測得到母離子響應值。以藥物的濃度為橫坐標，響應值為縱坐標，繪制基質標準曲線。結果表明，每種藥物在1 000 mg/L檢出限范圍內，線性關系良好，相關系數R2≥0.990 0。以能夠觸發二級質譜掃描的各化合物最小峰面積為評價標準，通過不同加標水平確定方法檢出限。本方法的檢出限為1～50 μg/kg，其中，有100種藥物的檢出限為1 μg/kg，有42種藥物的檢出限為5μg/kg，33種藥物的檢出限為10 μg/kg，24種藥物的檢出限為50 μg/kg，各藥物的檢出限列于表1。

2.5 回收率和精密度

為考察本方法的準確性，對空白魚、蝦樣品進行標準添加實驗，添加水平分別為1、5、10和50 μg/kg，每個添加水平做5個平行樣，按1.3節方法處理和檢測，計算不同添加水平下藥物的回收率和精密度。結果表明，在不同的加標水平下，200種藥物的平均回收率為30%～120%；相對標準偏差在5%～30%之間，其中，RSD為5%～15%、15%～20%和20%～30%的比例分別為70%、10%和20%，且相對標準偏差20%～30%主要分布于低加標水平上。

注：1.磺胺二甲異嘧啶；2. 磺胺二甲基嘧啶；3.甲硝唑；4.磺胺二甲噁唑；5.磺胺二甲異噁唑；6.磺胺嘧啶；7.磺胺間二甲氧嘧啶；8. 磺胺鄰二甲氧嘧啶；9.多菌靈；10.福莫特羅；11.苯乙醇胺A；12.林可霉素；13.齊帕特羅；14.頭孢匹林；15.特布他林；16.喹乙醇圖1 混合標準溶液中部分藥物的提取離子流圖Fig.1 Extracted precursorion chromatograms of some drugs in mix standard solution

3 實際樣品篩查

應用本方法對48個鮮活水產品，包括南美白對蝦、鳊魚、草魚、鯉魚、鯽魚和大黃魚等進行篩查，結果表明，對蝦樣品中未檢出藥物殘留，鳊魚、草魚、鯉魚、鯽魚和大黃魚中均檢出藥物殘留，檢出率占樣品總量的21%。檢出藥物的種類包括乙氧喹啉、恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、甲氧芐啶、磺胺二甲基嘧啶、敵百蟲和依維菌素，其中有1個草魚樣品的藥物殘留較嚴重，同時檢出乙氧喹啉、恩諾沙星、環丙沙星、甲氧芐啶和敵百蟲5種藥物，含量分別為8.11、363.4、11.7、1 273和26.6 μg/kg，該樣品的提取離子流圖示于圖2。

圖2 草魚樣品中檢出藥物的提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of compounds detected in grass carp

4 結論

建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法快速同時篩查魚、蝦樣品中200種藥物。該方法的樣品前處理簡單、耗時短、檢測效率高、定性準確，可為養殖和流通環節中水產品質量安全監管及隱患排查提供技術支撐。