HPLC-MS/MS法同時測定雞肉中40種糖皮質激素和9種非甾體抗炎藥物殘留

陳晶燕，陳萬勤，劉 柱，梁晶晶，丁宇琦，趙超群，羅金文

(1.浙江工業大學，浙江 杭州 310014；2.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052)

糖皮質激素是一種固醇類激素，在調節免疫應答反應中起著重要作用[1]，具有抗炎、抗過敏和免疫抑制等作用。糖皮質激素還可以促進動物生長，因此有一些飼養者非法過量使用這些藥物以促進動物生長、降低飼養成本。然而，殘留在動物源性食品中的激素會影響食用者健康，導致高血壓、糖尿病、代謝系統紊亂和骨質疏松[2]等疾病。非甾體抗炎藥是一類不含有甾體結構的抗炎藥，具有抗炎和解熱鎮痛的作用。目前，非甾體抗炎藥在養殖業中應用越來越廣泛，但其在動物源性食品中的過量殘留會導致食用者發生高血壓、心肌梗死、心力衰竭和心律失常[3]等疾病。因此，許多國家都制定了動物源性食品糖皮質激素和非甾體類抗炎藥的嚴格限量標準。我國農業部第235號公告[4]規定：地塞米松和倍他米松在豬、牛的肌肉和腎臟中不得超過0.75 μg/kg，肝臟中不得超過2 μg/kg，牛奶中不得超過0.3 μg/kg；地西泮在所有動物食品中均不得檢出。

目前，糖皮質激素和非甾體類抗炎藥物的測定方法主要有高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-質譜法[7-9]、氣相色譜-質譜法[10]以及毛細管電泳法[11]等。其中，液相色譜-串聯質譜法因其高靈敏度和高選擇性，成為糖皮質激素和非甾體類抗炎藥物殘留分析中最常用的手段之一。常用的樣品前處理方法主要有固相萃取[12]、液-液萃取[13]、免疫親和色譜[14]和凝膠滲透色譜[15]等，但是存在操作復雜、費時等缺陷，不適用于大量樣品的快速檢驗。

雞肉樣品中基質比較復雜，為減少基質干擾，本工作擬選取90%乙腈-0.1%甲酸混合溶液提取目標化合物，經Oasis PRIME HLB固相萃取柱凈化，采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞肉中40種糖皮質激素和9種非甾體抗炎藥物殘留，希望建立一種適用于日常大批量樣品的定量檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460 LC-MS/MS液相色譜-質譜儀：美國Agilent公司產品；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司產品；Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)，Waters Oasis PRIME HLB固相萃取柱(6 mL, 200 mg)：美國Waters公司產品。

甲醇、乙腈：均為質譜純，德國Merck公司產品；甲酸：質譜純，美國Sigma Aldrich公司產品；其它化學試劑均為分析純。雞肉為市場購買。

40種糖皮質激素藥物：曲安西龍、氫化可的松、倍他米松、地塞米松、氟米松、倍氯米松、氫化可的松醋酸酯、地夫可特、甲基潑尼松龍醋酸酯、曲安奈德醋酸酯、倍他米松戊酸酯和安西奈德，中國食品藥品檢定研究院產品；潑尼松龍和潑尼松,中國藥品生物制品檢定研究所產品；可的松、氟氫可的松醋酸酯和潑尼松醋酸酯，加拿大TRC公司產品；甲基潑尼松龍、氟氫縮松、曲安西龍雙醋酸酯、潑尼松龍醋酸酯、氟米龍、倍他米松醋酸酯、布地奈德、氫化可的松丁酸酯、地塞米松醋酸酯、氟米龍醋酸酯、氫化可的松戊酸酯、氟輕松醋酸酯、二氟拉松雙醋酸酯、潑尼卡酯、阿氯米松雙丙酸酯、莫米他松糠酸酯和倍氯米松雙丙酸酯，美國藥典委員會產品；曲安奈德、可的松醋酸酯、氯倍他索丙酸酯和倍他米松雙丙酸酯，德國Dr. Ehrenstorfer公司產品；氟替卡松丙酸酯和氯倍他松丁酸酯，歐洲藥品質量管理局產品。

9種非甾體抗炎藥物：美洛昔康、醋氯芬酸、地西泮和氯苯那敏，中國食品藥品檢定研究院產品；吡羅昔康、保泰松和羅通定，中國藥品生物制品檢定研究所產品；依托考昔，加拿大TRC公司產品；塞來昔布，歐洲藥品質量管理局產品。

49種藥物的純度均大于97%。

1.2 標準溶液的配制

49種藥物標準儲備溶液：分別準確稱取各約10 mg的40種糖皮質激素和9種非甾體抗炎藥物于25.0 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成約0.4 g/L的標準儲備液，于-18 ℃避光保存，備用。

49種藥物混合標準儲備溶液：分別準確量取適量各單一成分對照品標準儲備溶液，混合后用30%乙腈-水溶液稀釋，配制成1 mg/L的混合標準儲備液，于4 ℃避光保存，備用。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品提取 稱取2.00 g均勻制備的雞胸肉泥樣品于50 mL高速離心管中，加入10 mL 90%乙腈(含0.1%甲酸溶液)搖勻，采用高速均質器以15 000 r/min均質約2.0 min，超聲提取10 min，以5 000 r/min離心5 min，取上層清液進行下一步凈化處理。

1.3.2樣品凈化 準確移取5 mL 1.3.1節得到的樣品上清液，過Oasis prime HLB固相萃取柱，控制流速1～2滴每秒，收集流出液，待樣液全部通過固相萃取柱后，用4 mL 90%乙腈-0.1%甲酸溶液清洗，收集全部洗脫液，40 ℃下氮氣吹至液面低于1 mL，并用30%乙腈溶液轉移定容至1.0 mL，漩渦混勻，過0.22 μm有機微孔濾膜，轉移至樣品瓶中，供LC-MS/MS分析。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min(30%B)，3～12 min(30%～75%B)，12～14 min(75%)，14～14.01 min(75%～30%B)；14.01～17 min(30%B)；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。

1.4.2質譜條件 采用電噴霧離子源(Jet stream ESI)，49種藥物均采用正離子模式檢測；多反應監測模式(MRM)；電離電壓4.0 kV(正離子掃描)，-3.5 kV(負離子掃描)；干燥氣流速7 L/min，溫度300 ℃；鞘氣流速10 L/min，溫度350 ℃；霧化氣流量2.07×105Pa。49種藥物的監測離子對及相關參數設定列于表1。

2 結果與討論

2.1 提取溶液的優化

糖皮質激素類藥物屬于弱極性化合物，易溶于有機溶劑，難溶于水。非甾體抗炎藥屬于酸性或中性藥物，在酸性條件下更易溶于有機溶劑。實驗考察了乙腈、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑的提取效果。結果表明，甲醇作為提取溶劑對糖皮質激素的提取效果較差；乙酸乙酯對糖皮質激素類藥物的提取效果較好，但是對非甾體抗炎藥的提取效果較差，且提取液中脂肪較多，不利于后續固相萃取凈化。乙腈對兩類藥物的提取效率優于甲醇和乙酸乙酯，對糖皮質激素的提取效率高于非甾體抗炎類藥物。

表1 49種藥物的質譜采集參數Table 1 Mass spectrometry parameters of 49 veterinary drugs

注：*為定量離子

為進一步提高提取液的提取效率，實驗比較了含不同濃度甲酸提取液的提取效果。考察了乙腈中加入0.1%、0.2%、0.3%甲酸以及不加甲酸的乙腈對目標物的提取效率。結果表明，加入甲酸后，各藥物的回收率都有所提高，其中吡羅昔康、美洛昔康、醋氯芬酸和保泰松的回收率明顯提高，且含0.2%、0.3%甲酸提取試劑的回收率與含0.1%甲酸提取試劑的回收率并無顯著的組間差異。因此，本實驗選擇含0.1%甲酸的乙腈作為提取液。

另外，實驗還比較了不同比例的乙腈水溶液的提取效果。分別采用乙腈含量為70%、80%、90%、95%的溶液(均含有0.1%甲酸溶液)進行提取效率優化實驗。結果表明，90%、95%和100%乙腈的提取率相對較高。此外，采用90%乙腈作為提取溶劑時，回收率較穩定，其原因可能是提取液含10%水，可以有效地降低提取液中的脂肪含量，從而減少凈化過程中脂肪的影響，因此選擇0.1%甲酸-90%乙腈溶液作為提取劑。

2.2 凈化條件的優化

雞肉中的基質較為復雜，包括蛋白質、脂肪、礦物質和磷脂等物質，提取后需凈化才能進行質譜分析，否則不僅會產生很嚴重的基質效應，還會污染質譜檢測器。樣品中的蛋白質在

90%乙腈水溶液中會發生變性，可通過高速冷凍離心沉淀去除，在高速冷凍離心的過程中，還可同時去除一部分脂肪和磷脂；然后，實驗采用Waters Oasis PRIME HLB、Waters Oasis HLB、Waters Sep-Pak C18三種固相萃取柱進行樣品凈化。其中，Oasis HLB和C18小柱要求在大比例水相的條件下上樣，故需先將樣品稀釋再上樣。實驗結果表明，Oasis HLB和C18小柱無法保留全部藥物，使用Oasis HLB固相萃取柱時，氯苯那敏、美洛昔康和醋氯芬酸的回收率較低；使用C18小柱時，氯苯那敏、羅通定、吡羅昔康和美洛昔康的回收率較低。Oasis Prime HLB固相萃取柱采用一步凈化，通過保留樣品基質中的雜質，流出目標物的方式實現樣品溶液的凈化，簡化了操作步驟，既有效除去了磷脂、脂肪等雜質干擾，又減小了待測組分損失。實驗對比了經過Oasis Prime HLB固相萃取柱凈化前后，磷脂類物質的凈化效果。采用磷脂類物質特征子離子m/z184，掃描其母離子的方式進行檢測，結果示于圖1。凈化前樣品的質譜響應約為7×106，凈化后樣品的質譜響應約為0.5×105，凈化率達到99%。綜上所述，本實驗選擇Oasis PRIME HLB固相萃取柱對樣品進行凈化。

2.3 液相色譜條件的優化

40種糖皮質激素類和9種非甾體抗炎藥物在C18色譜柱上均有較強的保留。本方法在相同的流動相比例下分別考察了幾種C18色譜柱對49種藥物殘留的分離效能，發現Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)的分離效果較好。

圖1 樣品提取液經Oasis PRIME HLB凈化前(a)、后(b)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the sample before (a) and after (b) purified by Oasis PRIME HLB

糖皮質激素類藥物的化學結構相似，存在多個同分異構體，因此在分離上存在一定難度。采用甲醇體系流動相時，各化合物無法完全分離，并且雜質干擾較多，目標化合物響應值較低。乙腈為流動相不僅能使同分異構體分離，響應值較高，而且還可以得到較完美的峰形。甲酸是糖皮質激素電離誘導過程不可缺少的物質，而且非甾體抗炎藥在酸性條件下更易溶于乙腈。實驗對比了乙腈與水、乙酸銨溶液、甲酸水溶液等多種流動相。結果表明，以乙腈與水為流動相會造成峰拖尾；以乙腈與乙酸銨水溶液為流動相會造成部分藥物峰形較差；以乙腈與0.1%甲酸水溶液為流動相時的分離效果最好且目標離子的信號響應值較高。因此，確定流動相為乙腈與0.1%甲酸水溶液。

2.4 質譜條件的優化

由于大部分非甾體抗炎藥含有電負性基團，在正離子模式下易結合質子形成準分子離子[M+H]+。糖皮質激素在正離子模式下得到的碎片離子信息多于負離子模式。在正離子掃描模式下，用Optimizer軟件對1.0 mg/L的所有化合物的單標溶液分別進行質譜參數優化，找到主要碎片離子、最優碰撞電壓和碎裂電壓，選擇干擾小、靈敏度高的離子作為定性離子，每種化合物選擇兩對離子，滿足歐盟委員會指令96/23/EC對定性分析的要求，并依據子離子相對豐度比(定性離子/定量離子)和化合物保留時間進行定性。利用MRM模式在優化的液相色譜和質譜條件下可以有效分離49種目標化合物，各藥物MRM色譜圖示于圖2。由于化合物較多，將保留時間相近的化合物置于不同的提取離子流圖中。

49種化合物中共有6組同分異構體，分別為潑尼松龍(2)和可的松(5)，潑尼松龍醋酸酯(14)和可的松醋酸酯(20)，氟輕松醋酸酯(29)和二氟拉松雙醋酸酯(30)，倍他米松(7)和地塞米松(8)，曲安奈德(11)、倍他米松醋酸酯(22)和地塞米松醋酸酯(25)，阿氯米松雙丙酸酯(33)和倍氯米松雙丙酸酯(39)。其中，前三組同分異構體的定量子離子和定性子離子不同，可根據提取定性離子對得到不同的色譜圖判定化合物。后三組同分異構體的定性/定量離子相同，如化合物7、8的定性/定量離子對均為m/z393.2/146.8，難以根據碎片離子進行區別，但二者的保留時間分別為4.48、4.68 min，可根據其保留時間區別化合物7和8。

2.5 方法學考察

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限 采用外標法定量，為了盡可能消除基質效應帶來的測量誤差，采用空白樣品提取液作為標準溶液的配制溶劑。稱取約2 g不含目標物的樣品于50 mL離心管中，按1.3節方法進行前處理，得到樣品基質溶液。精密量取一定體積1 mg/L的混合標準儲備溶液，用樣品基質溶液稀釋，配制成一系列濃度分別為2、5、10、50、100 μg/L的基質標準曲線工作溶液，在最佳的儀器條件下對標準溶液進行檢測，以定量離子峰面積對質量濃度進行線性回歸。結果表明，在2～100 μg/L范圍內，49種藥物的線性關系良好，線性相關系數均大于0.996。

采用基質液添加各藥物標準溶液，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限和定量限，結合各種藥物的殘留限量標準，確定曲安西龍、潑尼松、可的松、甲基潑尼松龍、氟氫縮松、潑尼松龍醋酸酯、甲基潑尼松龍醋酸酯、莫米他松糠酸酯、保泰松、地西泮的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.5 μg/kg；潑尼松龍、倍氯米松、曲安西龍雙醋酸酯、可的松醋酸酯、倍他米松醋酸酯、布地奈德、氫化可的松丁酸酯、地塞米松醋酸酯、倍氯米松雙丙酸酯、氯倍他松丁酸酯、美洛昔康、吡羅昔康、塞來昔布的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg；其余化合物的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

2.5.2加樣回收率實驗和精密度考察 對不含目標物的空白樣品進行加標回收率實驗，添加水平分別為2、10和20 μg/kg，采用優化后的方法進行前處理，每個濃度水平進行6次平行測試，計算回收率及相對標準偏差(RSD)。2 μg/kg加標水平下，49種藥物的回收率為64.5%～111.7%，RSD為3.5%～12.0%；10 μg/kg加標水平下的回收率為60.2%～100.4%，RSD為3.4%～11.9%；20 μg/kg加標水平下的回收率為61.6%～98.5%，RSD為1.3%～10.3%。以上結果表明，該方法的準確度和精密度良好，能夠滿足雞肉中糖皮質激素和非甾體抗炎藥測定的要求。

因篇幅所限，詳細實驗數據以附件形式提供，請登錄本刊網站下載。

注：峰序號與表1化合物序號一致圖2 雞肉中49種藥物的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 49 drugs in chicken tissues

2.6 實際樣品分析

利用該方法檢測了5批次雞肉樣品，通過比較樣品與對照品圖譜的保留時間以及監測離子通道的豐度比，判定樣品中是否含有糖皮質激素和非甾體抗炎藥，通過目標物的質譜響應峰面積與標準對照品比值確定目標物含量。5批樣品中有1批次樣品檢測出氫化可的松藥物，含量為1.6 μg/kg，但是氫化可的松在動物性食品中允許使用。該檢測結果表明，雞肉樣品中糖皮質激素和非甾體抗炎藥的檢出率較低。

3 結論

本實驗建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中的糖皮質激素和非甾體抗炎藥，采用Oasis PRIME HLB固相萃取柱，無需活化和平衡步驟，方便快捷，縮短了前處理時間，減少了有機試劑使用量。該方法操作簡單、適用性強、準確性好，方法靈敏度能夠滿足國際上對動物源食品中糖皮質激素和非甾體抗炎藥物殘留的同時定性、定量檢測的要求。