RNF168在乳腺癌組織中的表達(dá)分析*

羅小麗，劉自光，何慧君，吳國標(biāo)

（南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院 1.病理科；2.乳腺甲狀腺外科，廣東 順德 528300）

關(guān)鍵字：乳腺癌；RNF168；免疫組化

乳腺癌是女性群體中最常見的一種癌癥。在我國雖然乳腺癌的發(fā)病率和致死率處于相對比較低的水平，但是近幾年出現(xiàn)迅速增長的趨勢。乳腺癌的發(fā)生與基因組的不穩(wěn)定有著密切的關(guān)系，而細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定是通過各種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）修復(fù)機(jī)制，這種DNA修復(fù)對于阻止腫瘤的形成和發(fā)展很重要[1]。環(huán)指蛋白168（ring finger protein 168, RNF168）是一個與雙鏈DNA損傷有關(guān)的重要調(diào)節(jié)蛋白，它主要控制DNA的損傷反應(yīng)，比如同源DNA重組和非同源DNA修復(fù)[2]。這些損傷反應(yīng)對于維持基因組的穩(wěn)定和在雙鏈DNA損傷過程中的糾錯發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。正是因為RNF168的這種功能，所以它很可能在乳腺癌的誘發(fā)進(jìn)展過程中起著十分重要的作用。本研究收集至少319個臨床樣本，比較RNF168在癌組織與正常組織以及不同階段癌組織中的表達(dá)，確定RNF168與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而為乳腺癌的治療提供一個新靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 病例收集

收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬順德醫(yī)院2013年1 月-2016年1月乳腺癌手術(shù)標(biāo)本319例，319例均為女性；年齡26～79歲，平均（45.6±5.8）歲；病程3個月～2年，平均（1.0±0.2）年；腫瘤直徑為0.5～2.5 cm，平均（1.8±0.4）cm；體重指數(shù)（body mass index, BMI）為21～24 kg/m2，平均（22.5±0.5）kg/m2；其中浸潤癌298例，原位癌22例。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院倫理委員會審查（批件號：科研倫審20160901）。同時，本次研究內(nèi)容已告知研究對象知情，并已簽署知情同意書。

1.2 乳腺癌組織分級標(biāo)準(zhǔn)

癌癥患者的癌組織的發(fā)展程度由本院病理部門處獲得。根據(jù)TNM國際分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中I期66例，II期145例，III期96例，IV期12例。

1.3 免疫組化染色法

①標(biāo)本經(jīng)3.7%中性福爾馬林固定，常規(guī)取材，脫水處理，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。②免疫組織化學(xué)方法采用EnVision二步法，滴加過氧化物酶阻斷劑（3%過氧化氫）和動物非免疫血清（羊），小鼠單克隆抗體anti-RNF168購自Abcam（稀釋比例為1︰300），二抗（羊抗鼠/兔IgG聚合物）、DAB均購自邁新。

1.4 RNF168陽性細(xì)胞百分比評分方法

染色強(qiáng)度：陰性0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強(qiáng)陽性3分；細(xì)胞數(shù)百分比：小于5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，大于75%為4分。兩者分?jǐn)?shù)相乘得分0～7分為低表達(dá)，8～12分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計量資料行t檢驗。P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化方法分析RNF168蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)：陽性表達(dá)大部分在乳腺癌細(xì)胞和癌旁正常乳腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞細(xì)胞核，少部分在細(xì)胞漿。癌旁正常乳腺組織共68例，其中32例為陰性，36例為陽性，陽性率為53%，且均為低表達(dá)。乳腺癌病例共319例，其中24例陰性，295例陽性，陽性率為92%。RNF168在癌組織和癌旁正常組織依據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，其中I期病例陽性高表達(dá)占比17/66，II期病例陽性高表達(dá)占比78/145，III期病例陽性高表達(dá)占比60/96，IV期病例陽性高表達(dá)占比9/12。而且，RNF168蛋白在I期和II期的得分明顯高于癌旁正常組織（P =0.001），III期和IV期的得分明顯高于I期和II期（P =0.005），而根據(jù)年齡和BMI無法區(qū)分RNF168的表達(dá)情況，見圖1和表1。

圖1 RNF168在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)圖

表1 乳腺癌患者年齡、BMI和TNM分期的臨床特征統(tǒng)計 （±s，分）

表1 乳腺癌患者年齡、BMI和TNM分期的臨床特征統(tǒng)計 （±s，分）

臨床特征例數(shù)RNF168表達(dá)(平均分)t值P值年齡/歲

3 討論

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，女性當(dāng)中最常見的一種癌癥[3]。乳腺癌的發(fā)生與基因組的不穩(wěn)定有著密切的關(guān)系，而細(xì)胞維持基因組穩(wěn)定是通過各種DNA修復(fù)機(jī)制，這種DNA修復(fù)對于阻止腫瘤的形成和發(fā)展是很重要的[2]。雙鏈DNA的損傷被認(rèn)為是最重要的一類DNA的損傷[4]。研究表明，雙鏈DNA的損傷與乳腺癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系[5]。

在細(xì)胞中，有兩條主要的通路與雙鏈DNA的修復(fù)是有關(guān)系的，非同源性的末端重組和同源性的重組，這兩條通路的主要不同在于在修復(fù)過程中所需要的受損的雙鏈DNA模板不同[6]。同源重組修復(fù)受損雙鏈DNA已經(jīng)被很明確地證明通過識別乳腺癌易感基因，包括BRCA1和BRCA2[7]。但是沒有明確的證據(jù)表明非同源的末端連接與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)系。在非同源的末端連接中有關(guān)基因中，只有Ligase IV和Artemis這兩個基因被證明與內(nèi)梅亨綜合征以及聯(lián)合免疫缺陷有關(guān)系，而其他的基因則沒有發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8]。可能是因為非同源末端連接主要參與維持基因組的穩(wěn)定，因為患者缺失了非同源連接有關(guān)的基因會造成基因組的不穩(wěn)定[9]。

BRCA1/2是一類很重要的腫瘤抑制基因，BRCA1/2的突變經(jīng)常會增加患乳腺癌的幾率[9]。從BRCA1/2被發(fā)現(xiàn)開始，后續(xù)的對它的研究發(fā)現(xiàn)，它可以通過同源重組這條通路來參與修復(fù)雙鏈DNA的損傷。雙鏈DNA的損傷可以被多個因素引起，比如缺氧以及紫外線照射等，不正確的損傷修復(fù)通常會導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定以及腫瘤的發(fā)生[10]。作為一個腫瘤抑制基因，BRCA1的缺失會引起大約55%～65%的女性患乳腺癌，大約45%的女性如果缺失雙鏈DNA修復(fù)基因BRCA2到70歲時會出現(xiàn)乳腺癌[10]。BRCA1/2蛋白的功能是基于自身結(jié)構(gòu)的，主要由兩部分組成，RING區(qū)域主要是作為E3s泛素鏈接酶；BRCT區(qū)域是一個磷酸化蛋白結(jié)合位點(diǎn)，特異性結(jié)合ATM/ART激 酶[11]。

研究表明，BRCA1缺失的細(xì)胞中RNF168可以通過泛素化H2A/H2AX抑制同源重組對受損雙鏈DNA的修復(fù)[12]；還有研究表明，在BRCA1缺失的細(xì)胞中，RNF168-R57依賴的組蛋白的泛素化對抑制同源重組對雙鏈DNA的修復(fù)起重要作用[13]。說明RNF168可以通過泛素化來影響DNA損傷反應(yīng)，同時也說明BRCA1可以抑制RNF168的這種影響。

RNF168有一個N末端RING手指區(qū)域，3個泛素結(jié)合區(qū)域和兩個與泛素相互作用的序列，研究表明RNF168通路在介導(dǎo)DNA損傷過程中發(fā)揮著重要作用。RNF168通過識別位于受損DNA兩側(cè)的被RNF8泛素化的非核小體蛋白而結(jié)合在DNA的受損部位[14]。通過泛素結(jié)合酶UBC13，RNF168開始啟動組蛋白H2A以及H2AX的泛素化，從而導(dǎo)致DNA受損反應(yīng)蛋白聚集到DNA損傷的部位[15]。雖然RNF8以及H2AX在DNA受損反應(yīng)蛋白聚集的過程中發(fā)揮了重要的作用，但是研究表明，在沒有RNF8以及H2AX存在的情況下，DNA受損蛋白仍然會聚集到DNA受損部位[16]。相反，在RNF168缺失的小鼠成纖維細(xì)胞中，53BP1在DNA受損部位的聚集就發(fā)生了障礙，這表明，RNF168除了在DNA損傷的通路H2AX-MDC1-RNF8這條通路中發(fā)揮作用外，還可以自己獨(dú)立地發(fā)揮作用。RNF168在53BP1聚集在DNA損傷部位之前就將其泛素化，這對53BP1啟動DNA損傷反應(yīng)有著重要的影響[17]。

綜上所述，RNF168可以通過泛素化DNA損傷反應(yīng)蛋白53BP1來減弱DNA損傷反應(yīng)，從而使DNA修復(fù)受阻。RNF168的缺失可以降低其引起的泛素化效應(yīng)，從而使腫瘤抑制因子53BP1能夠不被降解，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用[18]。因此從理論上講，RNF168起著潛在的可以影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，可能與乳腺癌的發(fā)展有著密切的聯(lián) 系。

本研究通過免疫組織化學(xué)的方法比較319例乳腺癌患者RNF168蛋白的表達(dá)，可以看出，RNF168的表達(dá)量隨著乳腺癌發(fā)展程度越來越高。這說明隨著乳腺癌的發(fā)展，RNF168逐漸積累，使機(jī)體對抗DNA損傷的反應(yīng)越來越弱，從而使癌癥向著越來越惡化的方向發(fā)展。這說明，RNF168對乳腺癌的發(fā)展起著重要的作用，進(jìn)而說明，RNF168可以作為判斷乳腺癌發(fā)展程度的一個指標(biāo)，或許可以作為治療乳腺癌的一個靶點(diǎn)。關(guān)于RNF168如何影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識現(xiàn)在還不是很清楚，目前只知道它可以通過泛素化影響DNA損傷的修復(fù)。筆者相信，隨著對RNF168在乳腺癌中的作用的深入研究，可以更好地了解乳腺癌在早期發(fā)生的機(jī)制，從而更好地為治療乳腺癌提供更多選擇。