熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)在梅毒患者診斷中的應(yīng)用價值

李曉燕

（深圳市龍崗區(qū)第六人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518000）

目前，臨床上篩檢梅毒的手段豐富多樣，其中快速血清反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）、梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP enzyme-linked immunosorbent assay, TP-ELISA）在患者首診時已經(jīng)得到廣泛開展，但是文獻(xiàn)報道[1]，RPR特異性低，假陽性率較高，其靈敏度只有在梅毒的繼發(fā)期才能達(dá)到95%，而當(dāng)待檢血清內(nèi)抗體含量過高，TP-ELISA會出現(xiàn)前帶效應(yīng)，影響診斷結(jié)果。近年來，隨著基因技術(shù)的發(fā)展，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR）由于操作簡便，價格低廉被用于淋巴結(jié)結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎及丙型肝炎等疾病的診斷[2-3]，但是其在梅毒診斷中的應(yīng)用價值鮮有報道，本文對此進(jìn)行初步探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2016年6月-2018年6月本院接收的70例經(jīng)病史、臨床癥狀及血清學(xué)試驗(yàn)確診的70 例梅毒患者為病例組，同期接收的20例非梅毒患者為對照組。病例組男33例，女37 例；年齡23～58 歲，平均（41.75±3.41）歲，對照組男12 例，女8例；年齡21～59歲，平均（42.07±2.96） 歲。兩組在年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。研究對象年齡在18～75歲，知情同意，意識清楚，無交流障礙，病例組經(jīng)病史、臨床癥狀及血清學(xué)試驗(yàn)確診，且符合1995年衛(wèi)生部防疫司頒布的梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，排除合并重要器官嚴(yán)重疾病者，排除近1個月內(nèi)有創(chuàng)傷、手術(shù)患者。

1.2 方法

標(biāo)本采集：于肘正中靜脈采集患者晨起空腹靜脈血4 ml，置于未加抗凝劑的潔凈玻璃試管內(nèi)，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm）分離血清待檢。

FQ-PCR法：向血清樣品中滴入5滴指示劑并適度用力混勻，陰性對照、陽性對照和待測標(biāo)本中分別加入1 000、500和500 μl裂解液，于65℃水浴箱中裂解0.5 h以制備探針。抽取20 μl預(yù)先配置好的探針至羅氏Lightcycler 96實(shí)時熒光定量PCR儀96孔微孔板，抽取待檢測樣本后以1 500 r/min離心5 min后樣本變?yōu)辄S色，用膠紙封口后于65℃孵育1 h，靜置5 min徹底冷卻。利用移液器將特異性抗體與DNA-RNA雜交之后形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到含有特異性抗體的捕獲孔，以膠紙封閉后于室溫下1 200 r/min振搖1 h，去除上清液后置于吸水紙。將偶聯(lián)有堿性磷酸酶的第二抗體與RNA雜合體100 μl至各捕獲孔，膠紙封蓋后室溫下靜置0.5 h，快速反轉(zhuǎn)并去除液體至干燥。利用由雙蒸水配置而成的沖洗液對其進(jìn)行反復(fù)沖洗，5次后置于吸水紙上干燥。吸取100 μl樣本室溫下置于暗處10 min，進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增后分析熒光強(qiáng)度。選擇已公布的Tp polA保守序列：GenBank TPU57757設(shè)計一對引物，引物序列和探針序列及標(biāo)記如下：上游引物P1︰5，-GGTCCTITGTCTITCGTA-3，下游引物P2︰5，-CTATTGCGATTGACCTGG-3，熒光探針：5，-(FAM)-ACACGCTCCTAACGTCC-DAB-(MGB)-3。

擴(kuò)增條件：預(yù)變性93℃，2 min；變性93℃，45 s；退火55℃，60 s；延伸72℃，60 s，共40 個循環(huán)。FT-PCR循環(huán)擴(kuò)增圖見圖1。

圖1 FT-PCR循環(huán)擴(kuò)增圖

RPR法、TP-ELISA法操作步驟嚴(yán)格按照說明書上的規(guī)程進(jìn)行操作。比較3種檢測方式的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料采用t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPR、TP-ELISA和FQ-PCR 3種檢測方式檢測結(jié)果

90例研究對象，RPR法檢測出陽性49例，TP-ELISA法52例，F(xiàn)Q-PCR法測出陽性65例。3種方法檢測結(jié)果與確診結(jié)果比較見表1～3。

2.2 不同檢測方法對梅毒診斷價值比較

應(yīng)用FQ-PCR對梅毒診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及診斷準(zhǔn)確率均顯著高于RPR與TP-ELISA（P ＜0.05）。見表4。

表1 RPR檢測結(jié)果與確診結(jié)果比較 例

表2 TP-ELISA檢測結(jié)果與確診結(jié)果比較 例

表3 FQ-PCR檢測結(jié)果與確診結(jié)果比較 例

表4 不同檢測方法對梅毒診斷價值比較 %

3 討論

梅毒病因多樣，除早婚早育、多次分娩、多次流產(chǎn)以及多個性伙伴外，感染蒼白螺旋體是其重要誘因。蒼白螺旋體感染屬于一種性傳播疾病，通常情況下感染的高峰年齡段集中于18～28歲且可同時感染一種或者多種類型的蒼白螺旋體。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球每年約有1 200萬人次感染病毒，我國從上世紀(jì)九十年代梅毒的增長速度高達(dá)60%[5]。在初期可無任何明顯癥狀，絕大多數(shù)患者在3～4個月時自行消失，但當(dāng)機(jī)體免疫力低下、重復(fù)感染、蒼白螺旋體持續(xù)存在或感染高風(fēng)險型蒼白螺旋體時將會引起靶抗原釋放，易損傷人體的多個重要器官與臟腑，病情極危的梅毒能夠引起身體殘疾從而累及正常工作和生活，成為我國重點(diǎn)防治的、危害最重的一類性病。

梅毒患者蒼白螺旋體感染針對體內(nèi)正常細(xì)胞的不同成分生成相應(yīng)的抗體，血清中的多種抗體（抗核抗體、抗可提取核抗原抗體及抗雙鏈DNA等）和體液免疫因子（免疫球蛋白和補(bǔ)體等）表現(xiàn)異常[6]。RPR法基于抗心磷脂抗體具有高親和力的特征，消長曲線與梅毒的臨床癥狀相關(guān)性較好，采取已知的牛心肌脂抗原作為參考免疫指標(biāo)達(dá)到檢測的原始目的，具有檢測耗費(fèi)時間少、試劑成本低廉等好處，但是假陽性率較高[7-8]。本研究結(jié)果顯示RPR對梅毒診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、診斷準(zhǔn)確率分別為70.0%、30.0%、77.8%、22.2%、61.1%，提示RPR對梅毒診斷假陽性率較高，與文獻(xiàn)報道基本一致。TPELISA有效地彌補(bǔ)了RPR法存在的不足之處，敏感性高、特異性強(qiáng)，但是IgM在機(jī)體免疫反應(yīng)中最先產(chǎn)生，易受病情活動及臨床治療影響出現(xiàn)假陰性反應(yīng)[9-10]，本研究也證實(shí)了其在梅毒診斷中的局限性。因此，盡管上述兩種方法均能夠取得較為理想的篩查效果，但在長期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)二者均存在著一定的不足之處，使得梅毒篩查結(jié)果難以滿足臨床早期診療工作需求。

PCR擴(kuò)增技術(shù)是一種在體外復(fù)制DNA片段的技術(shù)，脫氧核糖核酸的半保留復(fù)制機(jī)制是生命體進(jìn)化演化和傳遞遺傳信息的獨(dú)特途徑，因此其實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的基本原理與DNA的體內(nèi)天然合成復(fù)制過程非常相似，只要在試管內(nèi)提供DNA體外復(fù)制所需的原料、在合適的反應(yīng)條件下就可以進(jìn)行。FQPCR法基于熒光素標(biāo)記的單克隆抗體特異性結(jié)合表面抗原，形成“抗原-抗體-熒光素”結(jié)合物，借助熒光顯微鏡495 nm波長照射，能夠發(fā)出絕色熒光，而且單克隆抗體是單個B淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞分裂出細(xì)胞系分泌抗體，只能識別抗原分子上特定抗原，一則表現(xiàn)為抗體特異性均一性，而且表現(xiàn)為類、亞類以及親和力上也為均一性[11-12]。本研究針對“FQ-PCR在梅毒患者診斷中的應(yīng)用價值”進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：90例研究對象，RPR法檢測出陽性49例，TP-ELISA法52 例，F(xiàn)QPCR法測出陽性65例，F(xiàn)Q-PCR檢測梅毒的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及診斷準(zhǔn)確率顯著高于RPR與TP-ELISA（P ＜0.05），與文獻(xiàn)[12]中學(xué)者的研究結(jié)論基本一致，提示FQPCR對于梅毒診斷價值高于RPR與TP-ELISA，考慮是由于其采用常規(guī)PCR技術(shù)層面增添標(biāo)記的特異性探針，替代了紫外線觀察和電泳試驗(yàn)而杜絕了污染源，可以準(zhǔn)確定量測定Tp-DNA的水平，同時既排除了人為主觀因素的影響，此外，可以避免紫外線對人體的危害，有效保證檢驗(yàn)人員的健康[13-15]。但是，本研究中未對梅毒患者進(jìn)行分期研究，且病例數(shù)較少，臨床上還需要更大樣本量，對FQ-PCR的應(yīng)用價值進(jìn)行深入研究。

綜上所述，應(yīng)用FQ-PCR檢測梅毒具有較高的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度，值得臨床上推廣應(yīng)用。