MassworksTM結合NIST11譜庫在羊油香氣成分準確定性分析中的應用

齊安安，馬靈飛，雷春妮，張雅珩，馬 鑫，龐偉強，周小平,

(1.西北師范大學地理與環境科學學院，甘肅 蘭州 730070；2.中南大學化學化工學院，湖南 長沙 410012；3.甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，甘肅 蘭州 730070；4.江蘇理工學院，江蘇 常州 213100)

食用油是人們生活的必需品，在增加食物色、香、味方面起著重要作用，也是人體不可缺少的營養來源之一[1]。羊油屬于食用油的一種，具有補虛、潤燥、祛風、化毒之功效[2-4]。目前，對植物油風味以及香氣成分的研究較為普遍，如番茄籽油、花生油、芝麻油和芝麻香精等[5-9]，但對羊油香氣成分的研究則鮮有報道。

測定香氣成分常用的樣品預處理方法主要有頂空法、固相微萃取法、同時蒸餾萃取法、加速溶劑萃取法等，這些方法在一定程度上可解決復雜基質干擾問題，但各有其局限性。頂空法操作簡單，但靈敏度低；固相微萃取法的萃取頭對揮發性成分的吸附具有選擇性，不能全面反映樣品的揮發性成分；同時蒸餾萃取和加速溶劑萃取等傳統技術通常需消耗大量有機溶劑，對人體和環境都會造成危害。熱脫附法操作簡單、靈敏度高、無需使用有機溶劑，綠色環保[10]，目前已用于檢測空氣環境、花香以及材料等的揮發性有機物[11-12]，而將其用于測定食品風味的研究較少，尚未見熱脫附法應用于動物油香氣成分分析的報道。

香氣成分的定性一般通過單一譜庫匹配度結合保留指數確定，實驗步驟較繁瑣。由于低分辨質譜中的雜質、噪聲與化合物共流出物以及同位素離子峰的影響[13]，僅使用低分辨質譜對目標物定性時，會出現同一質譜圖具有多個高匹配度的化合物、匹配度相近、匹配度極低的現象[14]，且無法精確測定化合物的質量[15]，這給化合物的準確定性造成困難，而高分辨質譜的應用成本較高[16]。MassworksTM質譜解析軟件利用精確質量數測定和線性同位素峰形校正專利技術，使低分辨質譜實現了高分辨的功能[17-18]。國內外均有MassworksTM在化合物定性分析方面的應用研究。其中，Groveman等[19]用MassworksTM實現了石墨烯氧化物精確質量數的測定；周圍等[20]利用其實現了玫瑰精油中部分天然產物的分析并確定了元素組成。利用MassworksTM可以由已知的離子式計算出準確理論分子質量，通過峰形矯正，獲得對稱的峰形圖[21]。對實測的原始掃描質譜圖，通過校準獲得優化后的質譜圖，其質量準確度大大提高，可使低分辨質譜獲得高精度的質譜圖。

本研究擬采用熱脫附-氣相色譜-質譜聯用技術(TD-GC/MS)分析羊油的香氣成分，利用MassworksTM質譜解析軟件結合NIST11譜庫對檢測到的揮發性成分進行定性分析，希望為天然產物香氣成分的分析研究提供方法借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司產品；MassworksTM質譜解析軟件：美國Cerno Bioscience公司產品；AutoTD自動熱脫附解吸儀、不銹鋼采樣管(90 mm×6.4 mm，內裝150 mg Tenax-TA吸附劑)、集熱式恒溫加熱器、20 mL頂空瓶：中國成都科林儀器公司產品；SHC型計量型空氣泵：山東塞克賽斯氫能源有限公司產品； KQ-600DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產品；正己醇標準品：國藥集團化學試劑有限公司產品；β-蒎烯、1,4-二氯苯、檸檬烯：天津市登峰化學品有限公司產品。

1.2 樣品制備與采集

將市售羊肉脂肪切碎，置于鉗鍋中，于105 ℃烘箱中熬制1 h，獲得液體羊油樣品。用移液管移取8 mL羊油樣品于20 mL頂空瓶中，立即封口，置于集熱式恒溫加熱器中，在80 ℃下通過隔墊將已老化好的不銹鋼采樣管一端插入頂空瓶中(距離油面1 cm)，并在頂空瓶頂端插入細銅管與外界相通，以保持頂空瓶內氣壓平衡，不銹鋼采樣管另一端與空氣泵相連，以150 mL/min的速率采集60 min，采樣結束后將采樣管取下，密封，待測。

1.3 儀器參數

1.3.1熱脫附儀條件 一級解吸溫度180 ℃，解吸時間5 min；二級解吸溫度280 ℃，解吸時間8 min；進樣時間60 s；冷阱溫度-30 ℃；傳輸線溫度200 ℃；閥溫度150 ℃；載氣：高純氦氣(純度≥99.999%)，載氣壓力90 kPa；驅動氣體為空氣。

1.3.2色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX(60 m×0.250 mm×0.5 μm)；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至210 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)；進樣口溫度260 ℃；恒壓模式68.95 kPa；分流比為5∶1。

1.3.3質譜條件 EI離子源；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；溶劑延遲3 min；采樣模式為全掃描，質量掃描范圍m/z25～550。以全氟三丁胺(PFTBA)標準品為外標對質譜圖進行校正。

2 結果與討論

2.1 參數優化

熱脫附的吸附時間、冷阱條件會對樣品測定產生較大影響。因此，依據所測物質的組分數量和總峰面積[22]，通過對吸附時間、冷阱溫度進行優化，確定分析羊油香氣成分的最優熱脫附參數。

2.1.1吸附時間優化 吸附時間對樣品香氣成分富集影響較大，本實驗考察了吸附時間為20、40、60、80 min的測定結果，示于圖1。隨著采樣時間的增加，總峰面積和化合物個數均增加，但吸附80 min時，總峰面積和化合物個數均有減少趨勢，這可能由于過長的吸附時間影響了吸附-解吸平衡。綜合考慮樣品分析的效率，最終選擇吸附時間60 min。

2.1.2冷阱參數優化 設置其他條件不變，考察冷阱捕集溫度為0、-10、-30 ℃時對測定結果的影響，示于圖2。隨著冷阱溫度的降低，總峰面積和化合物的個數均增加，在-30 ℃時化合物個數和總峰面積均最高，由于儀器的冷阱捕集溫度最低為-30 ℃，故將冷阱的捕集溫度確定為-30 ℃。另外，對冷阱的解吸時間(5～10 min)和解吸溫度(260～280 ℃)進行優化。結果表明，冷阱的解吸時間和溫度對總峰面積和香氣組分個數均未產生明顯影響，為避免每次進樣交叉污染，最終確定解吸溫度為280 ℃，解吸時間為8 min。

圖1 吸附時間對測定結果的影響Fig.1 Effect of adsorption time on measurement results

圖2 冷阱溫度對測定結果的影響Fig.2 Effect of cold trap temperature on measurement results

2.2 建立校正函數

全氟三丁胺性質穩定，很難與其他物質反應，質譜裂解狀態固定，裂解效率、離子響應均較高，將其作為校準標準品，用MassworksTM軟件對質量軸和質譜峰形進行校正。選擇合適的質量掃描范圍(m/z400～410)獲得質譜圖，全氟三丁胺離子碎片的質量數幾乎涵蓋了目標化合物的質量掃描范圍(m/z25～550)，即以碎片CF3+、C2F4+、C2F5+、C3F5+、C4F9+等進行校正。優化FWHM Overall Fraction參數(可優化范圍為0.4～0.2)，使精確質量數達到最優，所得譜圖精度均在99.4%以上，質量誤差控制在0.356 3 mu以內。

根據標定離子的理論質量數和同位素分布獲得校正函數，該函數適用于常用的質量范圍(m/z0～500)。利用MassworksTM將校正函數運用于羊油香氣的原始掃描質譜圖中，校正后獲得目標物的精確質量數，再經MassworksTM線性同位素峰形校正檢索技術(CLIPs)，實現了目標物分子式的準確識別。

2.3 樣品成分分析

2.3.1MassworksTM技術應用 由TD-GC/MS得到羊油香氣全掃描模式下的總離子流色譜圖，首先進行NIST11譜庫檢索，由于受到多種因素干擾，保留時間在10.897、19.928、20.473、26.102、28.809、29.869、30.480、53.674 min的色譜峰匹配度均比較低，即使在NIST11譜庫檢索中逐個扣除背景，仍無法排除干擾。利用MassworksTM進行峰形校正，通過優化功能參數獲取最佳的譜圖精度，可大大提高樣品譜圖與NIST11譜庫的正反匹配度。對羊油香氣原始掃描圖，保留時間在10.897 min處的色譜峰通過MassworksTM背景扣除前后的對比，示于圖3。背景扣除后，m/z28.036 7、32.025 5等干擾碎片離子被扣除，將未知化合物的質譜圖與標準譜圖比對，可獲取未知化合物信息。背景扣除前后的化合物信息列于表1，可見，背景扣除前的質量誤差為9.433 7 mu，背景扣除后的質量誤差降至6.633 7 mu。

2.3.2共流出物的判斷 為確定羊油色譜峰中是否有共流出化合物，以40.032 min處的色譜峰為例進行分析，結果示于圖4。其質譜圖中有3個相對豐度較高的離子峰，分別為m/z145.978 9、147.972 7、149.949 5，利用MassworksTM質譜解析軟件的CLIPs功能逐一進行檢索，其中m/z147.972 7、149.949 5離子峰在MassworksTM參數允許范圍內未檢索到化合物，m/z145.978 9處碎片離子峰檢索到譜圖精度98.55%，質量誤差9.5 mu的化合物C6H4Cl2，經與標準品比對驗證，與MassworksTM確定結果一致。因此，MassworksTM的CLIPs功能可為判斷是否有共流出化合物提供參考。

圖3 MassworksTM扣除背景前(a)、后(b)的質譜圖Fig.3 Mass spectra of before (a) and after (b) subtracting background by MassworksTM

背景扣除Subtracting background分子式Formula精確分子質量Exact mass質量誤差Mass error/mu譜圖精度Spectral accuracy前C6H8O96.0579.433799.8007后C6H8O96.0576.633799.8158

2.3.3不穩定化合物的分析 在質譜裂解過程中，一些醇、醛類化合物不穩定[23]，其質譜圖中分子離子峰豐度較低，很難直接確定，可利用MassworksTM對質譜圖的離子碎片信息進行檢索，通過離子碎片匹配分析部分裂解機理。如保留時間32.594 min的化合物M，通過MassworksTM解析出其碎片離子分別為C6H12+、C5H9+、C4H8+等，結果列于表2，其碎片離子峰形圖示于圖5。目標化合物發生電離，失去氧原子的1個n電子，生成奇電子離子，游離基定域于氧上，并誘導β氫重排到氧上，接著失去H2O，得到[M-H2O]+奇電子離子m/z84。該奇電子離子繼續分解，失去穩定的中性基團，得到[M-H2O-(CH2)2]+奇電子離子，即m/z56；或者[M-H2O]+離子發生α斷裂，失去H生成[M-H2O-H]+偶電子離子，繼續分解失去穩定的中性基團，得到[M-H2O-H-CH2]+偶電子離子m/z69。由此可推測：未知目標物M為正己醇，經標準品比對與以上結果一致。

圖4 MassworksTM中的Mark an RT Window選取色譜峰掃描范圍Fig.4 Peak scan range selected by MassworksTM RT Window in Massworks

2.3.4羊油香氣成分的分析 應用TD-GC/MS采集羊油香氣的總離子流圖(TIC)示于圖6。采用NIST11譜庫進行檢索，實現樣品組分的初步分析，再通過MassworksTM質譜解析軟件對羊油香氣原始掃描總離子流圖進行校正，利用CLIPs功能獲取精確分子質量、質量誤差與譜圖精度，分析結果列于表3。

從羊油的整體香氣組成類別來看，烴類化合物占比重最大，為36%；醛類化合物次之，為33%；醇類化合物占9.5%；酮類化合物占7%；醚類、酯類以及雜類化合物各占4.83%。

對羊腰部、羊尾部的羊油樣品進行分析，發現2個部位的羊油香氣成分含量具有很大的差異。羊腰部羊油中正己醛占比最大，為19.49%，具有青草的香氣[24]；壬醛次之，占11.25%，具有油脂香[25]。羊尾部羊油中壬醛占比最大，為20.96%；3-羥基-2-丁酮次之，為20.01%；具有奶油的香味。本實驗結果與文獻報道[26]的羊肉中揮發性風味物質類型的含量有一定差異。這可為進一步分析羊油香氣中不同閾值的化學成分提供更多信息。

表2 C6H14O的碎片離子MassworksTM分析結果Table 2 MassworksTM analysis results of C6H14O fragment ions

圖5 MassworksTM中碎片離子峰形圖Fig.5 Fragment ions in MassworksTM

圖6 羊油香氣成分總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of aroma components of sheep oil

峰號No.保留時間tR/min分子式Formula化合物Compound精確分子質量Exactmass質量誤差Masserror/mu譜圖精度Spectralaccuracy正反匹配度Match/R.Match)羊腰部含量Relativecontent ofsheepwaist/%羊尾部含量Relativecontent ofsheeptail/%17.364C8H18正辛烷114.1403-6.802098.9887914/9164.319.6029.963C5H10O異戊醛86.0726-13.516499.4756857/8950.510.10310.897C6H8O反,反-2,4-己二烯醛96.05709.833799.2069756/8410.400.23411.100C8H18O二丁醚130.1352-9.716693.5050825/8501.260.07511.675C4H6O22,3-丁二酮86.0362-0.130999.7506849/9290.850.19611.957C5H10O戊醛86.0726-33.916499.2560908/9224.341.32712.849C10H203,7-二甲基-2-辛烯140.1560-8.452198.8081889/8990.860.12814.562C7H8甲苯92.062114.648399.0635925/9323.544.11916.424C6H12O正己醛100.088-15.86697.271945/96819.497.831019.023C8H10乙基苯106.0777-5.701799.9724907/9270.633.951119.263C5H8O反式-2-戊烯醛84.0570-6.166398.9270914/9190.720.011219.532C8H10間二甲苯106.0777-1.201798.8303925/9260.265.461319.928C8H10對二甲苯106.07776.798399.1133788/9211.622.401420.473C10H16β-蒎烯136.1247-9.751997.5418795/8050.190.021522.024C12H26十三烷170.2029-77.002399.3703806/8460.450.151622.233C7H14O庚醛114.1039-5.716597.6123951/9524.021.951723.174C10H16(+)-檸檬烯136.12470.048198.8403923/9282.720.281824.814C9H14O2-正戊基呋喃138.103910.683599.9265859/8652.366.681925.683C5H12O正戊醇88.0883??910/9202.331.252026.102C10H16(1S,3R)-順式-4-蒈烯136.1247-26.451998.9789777/8370.490.042127.150C8H8苯乙烯104.062119.248399.5110931/9323.960.24

續表3

注：*表示未檢出

3 結論

通過MassworksTM質譜解析軟件對背景扣除、共流出化合物判別、離子碎片信息檢索，分析得出羊油的香氣成分中含有15種烴類、14種醛類、4種醇類、3種酮類、2種脂類、2種醚類和2種其他物質。該方法從多角度對羊油香氣成分進行定性，解決了天然產物香氣成分定性的不確定性與單一性。通過對羊油的香氣成分進行準確定性，可為羊油的食用以及香氣成分的分離提供參考。