液相色譜-串聯質譜法測定蜂王漿中雙甲脒及其代謝物的殘留量

侯建波，謝 文，曾淦寧，張文華，史穎珠，錢 艷，周啟令

(1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016；2.浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，浙江 杭州 310016；3.浙江工業大學海洋學院，浙江 杭州 310014；4.浙江立德產品技術有限公司，浙江 杭州 310016)

蜂王漿可輔助控制血管擴張，具有降血糖、降血脂、降血壓、保護肝臟、抗菌消炎以及提高免疫力、抗衰老等功效[1]。我國是蜂王漿的主要生產國，產品主要出口日本、歐盟和美國等發達國家和經濟體[2]。隨著蜂王漿營養價值認可度的不斷提高，人們對其消費需求不斷增長，對其質量要求也越來越高，藥物殘留成為衡量蜂王漿產品質量的重要指標。

雙甲脒(amitraz)，又稱為N,N-雙(2,4-二甲苯亞氨基甲基)甲胺，是一種常見的有機氮殺蟲、殺螨劑，廣泛用于果樹、蔬菜、茶葉、棉花等作物的害蟲防治[3]。由于雙甲脒可以有效防治狄瓦氏螨引起的蜂病，且對蜜蜂低毒，因此廣泛用于蜂巢除螨[4-5]。雙甲脒易發生代謝或降解，生成單甲脒(DMPF)、2,4-二甲基苯基甲酰胺(DMF)和2,4-二甲基苯胺(DMA)，其代謝途徑示于圖1。其中，DMA在化工合成中常作為單甲脒和雙甲脒的合成原料，具有毒副作用和致突變性，對肝臟的損傷較大[6]。因此，各國紛紛制訂雙甲脒在農產品及蜂產品中的限量，以保證其質量安全，其中，歐盟、日本和美國規定蜂產品中雙甲脒限量為0.2 mg/kg，意大利和德國規定的限量為0.01 mg/kg，同時檢測其代謝物[7-10]。

圖1 雙甲脒的主要代謝路徑Fig.1 Metabolism routes of amitraz

目前，測定食品中雙甲脒及其最終代謝產物2,4-二甲基苯胺殘留量通常采用氣相色譜法[11-14]和氣相色譜-質譜法[15-19]，前處理方式以酸、堿環境下高溫水解樣品居多。對蜂產品的檢測主要集中于蜂蜜樣品[11-14,17-18,20-21]，而對蜂王漿的檢測報道較少[19,22]。隨著液相色譜和質譜的不斷發展，研究人員通過高效液相色譜(HPLC)法[23-24]和液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法檢測了食品、水和血液等樣品中雙甲脒及其代謝物[25-28]。

本工作擬采用固相萃取-液相色譜-串聯質譜法(SPE-LC-MS/MS)測定蜂王漿中雙甲脒、單甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的殘留量，希望為蜂王漿的質量控制提供方法和數據參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

1260-6495型液相色譜-串聯質譜儀：美國Agilent公司產品，配有電噴霧離子源；固相萃取裝置：美國Supelco公司產品；氮吹儀：美國Organomation公司產品；臺式離心機：美國Thermo公司產品；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司產品。

1.2 主要材料與試劑

中性Al2O3固相萃取柱(1 g/3 mL)和C18固相萃取柱(500 mg/3 mL)：中國上海安譜實驗科技股份有限公司產品；HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL)和MCX固相萃取柱(150 mg/6 mL)：美國Waters公司產品；乙腈、甲醇和甲酸：均為色譜純，美國Tedia公司產品；實驗用水：Milli-Q高純水；氨水：分析純，中國上海國藥集團產品；雙甲脒、單甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺標準品：純度均為99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司產品；雙甲脒-D6標準品：純度98%，加拿大TRC公司產品；2,4-二甲基苯胺-D6標準品：純度98%，加拿大C/D/N Isotopes公司產品。用乙腈將各化合物溶解、稀釋并定容，制得10 mg/L標準儲備液，再用乙腈將其稀釋至所需濃度。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品的提取 精確稱取2.00 g蜂王漿樣品于50 mL聚塞離心管中，加入20 ng同位素內標和8 mL 5%氨水溶液，以2 000 r/min渦旋混合1 min，靜置5 min；再加入10 mL 5%氨水-乙腈溶液，以2 000 r/min渦旋混勻1 min，靜置5 min，定容至20 mL，渦旋混勻；以8 500 r/min離心5 min，移取2.0 mL上清液，加入2 mL 5%氨水-乙腈溶液，渦旋混勻；以8 500 r/min離心5 min，取上清液，待凈化。

1.3.2樣品的凈化 將提取液轉移至中性Al2O3固相萃取柱，用2 mL 5%氨水-乙腈溶液洗滌固相萃取柱，接收流出液，40 ℃下氮吹至不足0.5 mL；加入乙腈定容至2 mL，再加入2 mL水，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.3色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：A為0.15%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～8.0 min(40%～65%B)，8.0～9.0 min(65%～95%B)，9.0～14.0 min(95%B)，14.0～15.0 min(95%～40%B)，15.0～19.0 min(40%B)；流速：0～8.0 min(0.4 mL/min)，8.0～9.0 min(0.4～0.7 mL/min)，9.0～15.0 min(0.7 mL/min)，15.0～16.0 min(0.7～0.4 mL/min)，16.0～19.0 min(0.4 mL/min)；進樣量10 μL；柱溫25 ℃。

1.3.4質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式；多反應監測模式(MRM)；毛細管電壓2 500 V；離子源溫度130 ℃；干燥氣流速16 L/min；鞘氣溫度250 ℃，流速11 L/min。其他質譜條件列于表1。

表1 各化合物基本信息及質譜測定條件Table 1 Basic informations and optimized mass spectrometric parameters

注：*表示定量離子對

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇

測定蜂王漿中藥物殘留時通常需要去除蛋白，以降低蛋白質對測定的影響。已有研究表明[26,29]，酸性環境下雙甲脒易分解。本實驗分別考察了1%、3%和5%氨水溶液對樣品的提取效果，以及1%、3%和5%氨水-乙腈溶液沉淀蛋白的效果。結果表明，向2 g蜂王漿樣品中加入8 mL 5%氨水溶液，提取液pH處于9～10之間，可保持提取液的酸堿度，有助于提高前處理過程中化合物的穩定性。加入5%氨水-乙腈溶液可有效沉淀蜂王漿中蛋白質，同時保持提取液的堿性環境，所以凈化固相萃取柱前，向提取液中再加入2 mL 5%氨水-乙腈溶液，可進一步沉淀蛋白質，以減少蛋白質對檢測結果的影響。

2.2 凈化條件的選擇

本實驗分別考察了C18、HLB、MCX和中性Al2O3四種固相萃取柱的凈化效果。實驗添加5 ng標準混合溶液，其中C18和HLB固相萃取柱采用5 mL水上樣，5 mL水淋洗，依次用5 mL二氯甲烷、甲醇、乙腈和二氯甲烷-乙腈-甲醇混合液(2∶1∶1，V/V/V)進行洗脫；MCX固相萃取柱采用5 mL酸性水溶液上樣，5 mL水淋洗，5 mL 5%氨化甲醇洗脫；中性Al2O3固相萃取柱直接用5 mL 5%氨化乙腈進行洗脫凈化，結果示于圖2。C18、HLB和MCX固相萃取柱對雙甲脒的回收率小于15%，對2,4-二甲基苯胺的回收率低于50%，中性Al2O3固相萃取柱對目標物的回收率均大于70%。因此，選擇中性Al2O3固相萃取柱進行樣品的凈化。

2.3 色譜條件的優化

樣品稀釋劑對待測物的峰形、分離度和靈敏度有一定的影響，本實驗比較了乙腈-0.15%甲酸水溶液(4∶6，V/V)和乙腈-水溶液(1∶1，V/V)作為樣品稀釋劑對色譜分離效果的影響。結果表明，采用乙腈-0.15%甲酸水溶液(4∶6，V/V)為稀釋劑，雙甲脒在8 h內幾乎完全分解；采用乙腈-水溶液(1∶1，V/V)為稀釋劑，各化合物可以在24 h之內穩定存在，且色譜峰峰形良好。故本實驗采用乙腈-水溶液(1∶1，V/V)作為樣品定容溶液。

注：a.二氯甲烷；b.甲醇；c.乙腈；d.二氯甲烷-乙腈-甲醇(2∶1∶1，V/V/V)；e.5%氨化甲醇溶液；f.5%氨化乙腈溶液圖2 使用不同洗脫液，C18、HLB、MCX和N-Al2O3固相萃取柱的凈化效果Fig.2 Purification effect of C18, HLB,MCX and N-Al2O3 SPE under different eluent fluid

參考相關文獻[26,28]，本實驗選擇C18柱對目標化合物進行分離。選擇0.15%甲酸水溶液為流動相的水相，分別考察了甲醇、乙腈為有機相的分離效果。結果表明，采用乙腈-0.15%甲酸溶液為流動相可以實現蜂王漿樣品基質干擾峰的良好分離，不影響目標物定量。空白蜂王漿基質加標溶液的檢測結果示于圖3。

2.4 質譜條件的優化

正離子模式下，采用直接進樣方式對1.0 mg/L待測物的標準溶液進行母離子全掃描，以確定分子離子峰，再對其子離子進行全掃描，各化合物的主要子離子及可能的碎片信息示于圖4。實驗選取信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對，以多反應監測正離子模式優化質譜參數，獲得的最佳質譜條件列于表1。由于雙甲脒容易發生源內裂解生成單甲脒，因此需降低毛細管電壓和離子源溫度。

3 方法驗證

3.1 線性關系和定量限

本實驗通過測定混合溶劑標準溶液和空白提取溶液基質加標標準溶液，計算離子抑制率，以評價基質效應[30-31]，結果列于表2。可見，單甲脒和2,4-二甲基苯胺的離子抑制率均大于30%，存在明顯的抑制效應。實驗采用添加同位素內標物和稀釋空白蜂王漿提取液配制標準工作曲線溶液的方式減弱基質效應。

圖3 空白蜂王漿基質加標溶液檢測結果(5.0 μg/kg)Fig.3 Separation results of royal jelly matrix (5.0 μg/kg)

以標準品與同位素內標物峰面積比值y為縱坐標(外標法以譜峰面積為縱坐標)，以待測物質量濃度x(μg/kg)為橫坐標，繪制各化合物標準溶液工作曲線，結果列于表3，在0～300 μg/kg濃度范圍內，線性相關系數R2均大于0.997。蜂王漿樣品中雙甲脒、單甲脒、2，4-二甲基苯基甲酰胺和2，4-二甲基苯胺的定量限(S/N=10)分別為0.05、0.5、5.0、0.5 μg/kg。

3.2 回收率及精密度

在不含各目標化合物的蜂王漿中進行5、10、100和200 μg/kg濃度水平的添加回收率實驗，每個濃度水平取6個平行樣，結果列于表3。雙甲脒和2,4-二甲基苯胺采用內標法定量，單甲脒和2,4-二甲基苯基甲酰胺采用外標法定量，方法回收率為50.5%～110%，相對標準偏差小于15.0%。

4 陽性樣品分析

應用本方法測定12批次不同品牌的蜂王漿樣品，未檢測到雙甲脒及其代謝物，該結果與GB 23200.103—2016檢測結果一致。

圖4 雙甲脒(a)、單甲脒(b)、2，4-二甲基苯基甲酰胺(c)和2，4-二甲基苯胺(d)的質譜圖和碎片離子結構式Fig.4 Mass spectra and possible fragment ions of amitraz (a), DMPF (b), DMF (c)and DMA (d)

化合物Compound離子對MRMtransition(m/z)溶液濃度Concentration/(μg/L)溶劑線性響應強度Intensity ofsolvent基質加標溶液響應強度Intensity ofblank matrix離子抑制率?Ration of ionsuppression/%雙甲脒294.2/163.20.55040290448487111.0單甲脒163.2/122.20.5133400882627738.12,4-二甲基苯基甲酰胺150.1/107.10.5157411768412.32,4-二甲基苯胺122.1/107.10.569970833420152.2

注：*離子抑制率(%)=(混合溶液中響應強度-空白蜂王漿基質加標溶液響應強度)×100%/混合溶液中響應強度

表3 4種化合物的線性關系和回收率(n=6)Table 3 Results of liner relationships and recoveries (n=6)

5 結論

本研究采用固相萃取-液相色譜-串聯質譜法測定蜂王漿中雙甲脒、單甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的殘留量。蜂王漿經氨水稀釋、氨化乙腈沉淀蛋白并提取，中性Al2O3固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯質譜多反應監測正離子模式檢測，同位素稀釋內標法和外標法定量。該方法簡便、快捷，可滿足目前國內外相關化合物最大殘留限量的檢測要求。應用該方法測定了12批次不同品牌的蜂王漿樣品，與標準方法測定結果一致。