UHPLC-LTQ-Orbitrap質譜法鑒定染料木素在大鼠體內的代謝產物

趙文靖，梁耀月，王子健，侯君釗，張連中，王志斌，張加余

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.北京中醫藥大學，北京中醫藥研究院，北京 100029；3.中國合格評定國家認可中心，北京 100062；4.北京鴻測科技發展有限公司，北京 100176)

染料木素(Genistein, GS)，又稱5,7,4’-三羥基異黃酮、染料木苷元、金雀異黃素、染料木黃酮，存在于多種可食性植物中，尤其在葛根、苜蓿、燕麥、槐角、小麥、大麥和廣豆根中含量較高[1-2]。染料木素作為一種活性功能較高的天然酪氨酸激酶，具有與雌激素相似的結構，因此被稱為“植物雌激素”[3-4]。近年來研究發現，染料木素還具有抗氧化[5]、降血脂[6]、抗腫瘤[7]和防治骨質疏松[8]等活性，現已廣泛應用于醫藥、保健品等領域。染料木素在體內可能生成脂肪酸酯化產物[9]，但并未見其體內代謝過程的報道[10]。

液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)結合了色譜的分離能力和質譜的高靈敏度、高專屬性的檢測能力，已成為中藥化學成分結構鑒定的手段之一[11-13]。其中，離子阱-靜電軌道場的聯用質譜(LTQ-Obitrap-HR-MS)兼有高分辨率、高質量精度等優點，可用于復雜物質體系中化學成分及體內代謝產物的快速分析[14-16]。SPE技術可從樣品中純化、濃縮微量成分或其代謝產物，目前已廣泛應用于生物樣品的前處理中。此方法解決了體內樣品成分復雜、干擾物質多、待測藥物濃度低等影響藥物分析的問題，從而獲得體內樣品成分分析的高靈敏度和低檢測限[17]。

本研究擬采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技術分析染料木素體內代謝產物，希望為闡明染料木素藥效物質基礎提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀和LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-靜電場軌道阱質譜儀器：美國Thermo Fisher公司產品，配有電噴霧離子源(ESI)，Xcalibur 2.1工作站；R200D型電子分析天平(1/10萬)：德國Sartorius公司產品；Milli-Q Synthesis超純水純化系統：美國Millipore公司產品；KQ-250DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產品；Grace PureTMSPE C18-Low固相萃取小柱(500 mg/3 mL)：美國Grace Davison Discovery Science公司產品。

1.2 主要材料與試劑

染料木素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷的對照品：成都曼思特生物科技有限公司產品，經HPLC面積歸一化法，測定其純度均大于98%；乙腈、甲醇：質譜級，美國Thermo Fisher公司產品；甲酸：色譜級，德國Merck公司產品；分析用水：Millipore超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；柱溫40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～2 min(5%～20%B)，2～27 min(20%～85%B)，27～30 min(85%B)，30～32 min(85%～5%B)，32～35 min(5%B)；流速0.30 mL/min；進樣量3 μL。

1.3.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負離子檢測模式，毛細管溫度350 ℃，鞘氣流速30 L/h位，輔助氣流速10 L/h，噴霧電壓3 kV，毛細管電壓-35 V，管透鏡電壓-110 V。樣品采用高分辨傅里葉掃描，分辨率30 000，質量掃描范圍m/z50～800，隔離寬度2 u；二級和三級質譜采用數據依賴性掃描(data dependent scan, DDS)，選取上一級豐度最高的2個峰進行碰撞誘導解離(CID)碎片離子掃描，激活能量單位0.25 q，激活時間30 ms，歸一化碰撞能量為40%。

1.4 動物分組與實驗

12只SD大鼠(雄性，體重220～250 g，許可證號為SCXK(京)2012-0001)：購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。SD大鼠隨機平均分為空白組和染料木素給藥組，實驗前適應性飼養3天(室溫22～26 ℃，濕度40%～70%，12 h晝夜更替)，受試前禁食12 h，全程不禁水。

給藥劑量：給藥組按200 mg/kg劑量給予CMC-Na混懸液；空白組大鼠灌胃等體積0.5%CMC-Na溶液。

1.5 生物樣品采集與處理

1.5.1生物樣品采集 空白組和給藥組大鼠灌胃后，立即置于代謝籠中開始計時，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h于眼眶靜脈叢下取約0.5 mL靜脈血，置于含肝素鈉抗凝EP管中；緩慢上下顛倒混勻，靜置15 min，于4 ℃以3 000 r/min離心15 min，合并同組上述5個時間點的血漿，即得空白血漿和含藥血漿。另一方面，收集兩組大鼠給藥后0～24 h內的尿液，于4 ℃以3 000 r/min離心15 min，取上清液。將上述樣品置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍儲存，備用。

1.5.2生物樣品的固相萃取處理 依次使用5 mL甲醇和5 mL水活化固相萃取小柱，取1 mL解凍后的血樣或尿樣上樣，用5 mL水洗脫，然后用3 mL甲醇洗脫并收集洗脫液，室溫下氮氣吹干；向殘渣中加入80 μL初始比例流動相(含5%乙腈)復溶，于4 ℃渦旋3 min后，以13 500 r/min離心15 min，取上清液，待LC-MS分析[17]。

2 結果與討論

2.1 染料木素的質譜裂解行為

在ESI負離子模式下，染料木素產生準分子離子峰m/z269.044 4，其二級質譜圖示于圖1。在ESI-MS2圖譜中，產生的多級質譜碎片離子有m/z241[M-H-CO]-、m/z240[M-H-CHO]-、m/z225[M-H-CO2]-、m/z213[M-H-2CO]-和m/z197[M-H-CO2-CO]-[18]，示于圖2。除此之外，染料木素還易發生RDA裂解，即C環1位和3位斷裂，產生碎片離子m/z151，裂解規律示于圖3。結合其他標準品的質譜裂解規律，本研究以連續產生CO中性丟失作為此類化合物的特異性裂解規律，為實現染料木素代謝產物的快速篩選及結構鑒定提供依據。

2.2 大鼠體內染料木素的代謝產物分析

根據獲得的精確分子質量數據推斷可能的元素組成，結合多級質譜裂解碎片和染料木素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷的特征性質譜裂解規律等信息，對染料木素的代謝產物進行結構分析，結果列于表1，對應的提取離子流圖示于圖4(誤差在±5×10-6以內)，代謝途徑示于圖5。

在負離子檢測模式下，化合物M0、M5、M9、M13、M14均產生準分子離子峰m/z269.044 4，推測其分子式為C15H9O5。在多級質譜圖中，均產生m/z241(脫去CHO基團)、m/z240(脫去一分子CO2)、m/z225(脫去一分子CO)、m/z201(脫去C8H6O2)、m/z197(連續脫去兩分子CO)、m/z185(脫去兩分子CO的基礎上開環脫去1個C原子)。鑒于以上化合物具有相似的質譜裂解規律，M0的色譜保留時間與染料木素標準品一致，因此，鑒定M0為染料木素，推測M5、M9、M13和M14為染料木素的同分異構體[19-20]。

圖1 負離子模式下，染料木素的MS2質譜圖Fig.1 MS2 spectrum of Genistein in negative ion mode

圖2 負離子模式下，染料木素主要的質譜裂解規律Fig.2 Fragment pathways of Genistein in negative ion mode

圖3 負離子模式下 ，染料木素RDA質譜裂解規律Fig.3 Retro-Diels-Alder (RDA) rearrangement of Genistein in negative ion mode

注：a.分子質量為m/z 239.070 2、253.049 5、255.065 2、257.080 8、267.065 2的代謝產物；b.分子質量為m/z 269.044 4、271.060 0、283.060 0、285.039 3、285.075 7的代謝產物；c.分子質量為m/z 287.091 3、299.055 0、333.006 3、337.037 6的代謝產物；d.分子質量為m/z 415.102 3、417.118 0、429.081 5、431.097 2的代謝產物圖4 給藥組大鼠生物樣品中染料木素代謝物的提取離子流圖Fig.4 High resolution extracted ion chromatograms of Genistein metabolites in rats of drug group

注：中括號為未確定取代基團的位置；虛線框為初步確定取代基團的位置——A環、B環或C環；R為取代基團圖5 染料木素在大鼠體內可能的代謝途徑Fig.5 Proposed metabolic patterns of Genistein in vivo in rats

在負離子檢測模式下，化合物M4和M19均產生準分子離子峰m/z283.060 0，其分子式為C16H11O5，分子質量較染料木素多14 u，初步推測為染料木素的甲基化產物。在多級裂解過程中，該離子失去一分子甲基，產生特異性碎片離子m/z268[M-H-CH3]-，表明甲基與羥基相連。其中，M4和M19產生特異性離子m/z165(在1位和3位發生RDA裂解)，進一步證明了甲基存在于A環。根據色譜保留行為，7-O-methylgenistein相對于5-O-methyl-genistein的ClogP越小，在反向色譜柱上的保留時間越短。因此，推斷M4和M19分別為5-O-methylgenistein(ClogP, 2.09)和7-O-methylgenistein(ClogP, 2.99)。

化合物M15、M23、M24和M25均產生準分子離子峰m/z299.055 0[M-H]-，推測其分子式為C16H11O6。在二級質譜圖中，均產生m/z284(脫去一分子CH3)，表明存在羥甲基。在三級質譜圖中，由m/z284的基峰離子產生m/z256(脫去一分子CO)和m/z228(脫去兩分子CO)，與染料木素類成分的裂解規律一致。因此，初步鑒定M15、M23、M24和M25為染料木素的甲基化和羥基化產物。

代謝產物M17產生準分子離子峰m/z285.039 3[M-H]-，其分子式為C15H9O6，分子質量較染料木素多16 u，推測為染料木素的羥基化產物。在多級質譜中，準分子離子通過連續丟失CO基團產生碎片離子m/z257、229；而特征性離子m/z151在1位和3位發生RDA裂解，進一步證明羥基化反應發生在B環。因此，鑒定M17為羥基化染料木素。

化合物M22產生準分子離子峰m/z271.060 0[M-H]-，其分子式為C15H11O5。在多級裂解過程中產生特異性離子m/z165(在C2和C3發生斷裂)和m/z151(在1位和3位發生RDA裂解)。因此，推斷M22為染料木素的還原產物，結構式列于表1。M20產生準分子離子峰m/z285.075 7[M-H]-，較M22分子質量多14 u，推測其為M22的甲基化產物。M20在MS2中通過中性丟失CH3產生特異性碎片離子m/z270，表明母核中存在甲氧基取代基團；碎片離子m/z164、150的產生進一步證明甲基化發生于B環上。因此，鑒定M20為染料木素的甲基化及還原反應產物。

化合物M8和M11在負離子檢測模式下均產生準分子離子峰m/z431.097 2，由精確分子質量推測其分子式為C21H19O10。在多級裂解過程中產生了特異性離子m/z269(中性丟失一分子葡萄糖)，推測其發生了葡萄糖基化反應。與染料木苷對照品對比，M8與染料木苷具有相同的保留時間和質譜裂解規律。因此，推測M8為染料木苷，M11為染料木苷的同分異構體。

負離子檢測模式下，化合物M3產生準分子離子峰m/z253.049 5，推測其分子式為C15H9O4。通過與大豆苷元對照品質譜裂解規律和保留時間的比對，鑒定其為大豆苷元。

化合物M1產生準分子離子峰m/z415.102 3[M-H]-，其分子式為C21H19O9，分子質量較大豆苷元多162 u，推測是大豆苷元的葡萄糖結合產物。在ESI-MS2質譜裂解中，產生特征性碎片離子m/z253[M-H-Glu]-進一步表明了葡萄糖基的存在；m/z197、196、135等碎片離子均提示與大豆苷元的裂解規律一致。通過與對照品比對，將其鑒定為大豆苷[21]。

化合物M2產生準分子離子峰m/z429.081 5[M-H]-，其分子式為C21H17O10。M2比大豆苷元多176 u，可初步推斷為大豆苷元的葡萄糖醛酸化產物。由于其多級裂解規律與大豆苷元類似，因此，將M2鑒定為大豆苷元的葡萄糖醛酸化產物[22]。

化合物M7、M16和M30均產生準分子離子峰m/z255.065 2[M-H]-，推測其分子式為C15H11O4，分子質量較大豆苷元多2 u，推測為大豆苷元的還原產物。在多級質譜中產生了特征性離子m/z149(在C2和C3發生斷裂)和m/z135(在1位和3位發生RDA裂解)，進一步證明脫氫反應發生在C環的雙鍵處。因此，將M7、M16和M30鑒定為大豆苷元的還原產物。

化合物M18和M27均產生準分子離子峰m/z257.080 8[M-H]-，推測其分子式為C15H13O4。在多級質譜中，M27產生特征性離子m/z163(在1位和3位發生斷裂)和m/z109(在C4和C10發生斷裂)，根據文獻[23]報道，將其鑒定為O-demethylangolensin。M18產生特異性離子m/z121、137，與文獻[23]報道一致，因此將其鑒定為大豆苷元的雙還原產物。

化合物M6產生準分子離子峰m/z337.037 6[M-H]-，其分子式為C15H13O7S。在ESI-MS2質譜裂解中，檢測到了中性丟失一分子磺化基團而產生碎片離子m/z257。而m/z257離子的進一步裂解規律與M18類似，提示該化合物與大豆苷元的質譜碎片信息類似，通過查閱文獻[24]，將其鑒定為M18的硫酸酯化產物。

負離子檢測模式下，化合物M21和M28均產生準分子離子峰m/z287.091 3[M-H]-，其分子式為C16H15O5。在二級質譜圖中產生了特異性離子m/z272(中性丟失一分子CH3)，證明母核中存在甲氧基取代基團。其中，M21通過RDA裂解產生特異性離子m/z151，據此推測甲基化反應和羥基化反應均未發生在A環。在M28的二級質譜中，經RDA裂解產生特異性離子m/z124，推測甲基化可能發生在A環。由于發生反應的具體位置未知，僅將M21和M28推測為M27的羥基化和甲基化產物。

化合物M12產生準分子離子峰m/z417.118 0[M-H]-，其分子式為C21H21O9。在多級質譜中產生了碎片離子m/z241，該離子較雌馬酚多176 u；且碎片離子m/z135、121與文獻[25]報道的雌馬酚裂解規律一致，因此將其鑒定為雌馬酚的葡萄糖醛酸化產物。代謝產物M26產生了準分子離子峰m/z239.070 2，其分子式為C15H11O3，比雌馬酚多2 u，推測為雌馬酚的還原產物，其質譜裂解規律與M12一致，均產生碎片離子m/z135、121。因此，將M26鑒定為雌馬酚的還原產物。

3 結論

本研究通過分析大鼠尿樣和血漿中染料木素代謝產物的精確分子質量、異黃酮類標準品的質譜裂解規律，并與空白組樣品進行比較，共篩選鑒定出31種染料木素代謝產物。染料木素在大鼠體內主要發生葡萄糖醛酸化、葡萄糖結合、羥基化、還原反應、甲基化、硫酸酯化及其結合反應等反應類型。研究表明，基于高分辨質譜技術的天然產物體內代謝研究方法，可較全面地用于染料木素的代謝過程研究，為染料木素進一步的藥動學研究、藥理活性研究等提供理論參考，同時也可為其他天然產物的代謝研究提供借鑒。