妊娠期慢性疼痛對母鼠認知功能影響機制研究*

周 芳 黃 悅 李 清 涂淑敏 劉玉平

（1徐州醫科大學護理學院，徐州 221004； 2北京清華長庚醫院麻醉科，北京 102218；3徐州醫科大學附屬醫院護理部，徐州 221002）

國際疼痛學會(International Association for the Study of Pain, IASP)將疼痛定義為一種與組織損傷或潛在組織損傷相關的感覺、情感、認知和社會維度的痛苦體驗。持續或間歇性持續3個月以上的疼痛被定義為慢性疼痛(chronic pain,CP)[1]。慢性疼痛持續時間長，治愈率低，導致病人機體功能失調，免疫力下降，從而誘發各種并發癥，嚴重影響病人的生活質量，增加家庭負擔，給社會也造成巨大損失[2]。

本課題組前期人群調查發現，慢性疼痛可造成孕婦發生焦慮和抑郁[3]，并導致其產程延長，出血量增加、新生兒Apgar評分較差[4]。在動物實驗中，我們發現了與人類調查極為類似的結果[5,6]。但近期我們在慢性疼痛模型的受孕小鼠中發現，其認知能力（學習、記憶）也有顯著下降，且具體機制不明。因此，本研究擬通過構建孕期小鼠慢性炎性痛模型，用水迷宮實驗觀測孕鼠認知行為，用酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)檢測慢性疼痛對孕鼠單胺類神經遞質水平的影響，并通過實施優裕胎教方案對慢性疼痛進行干預，以揭示妊娠期慢性疼痛對孕鼠認知功能影響的機制。

方 法

1.材料

實驗所用動物均為SPF級昆明小鼠，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（江蘇）2002-0038。選用未受孕過的雌性小鼠，65～90日齡，25～35 g，同批交配（交配用成年雄性小鼠，25～45 g），10～12 h后發現陰栓或陰道涂片發現精蟲者定為妊娠第 0天。選取40只成功受孕小鼠，隨機分為四組（每組10只）：正常對照組、假手術對照組、慢性疼痛組、慢性疼痛（下簡稱“慢疼”）+優裕胎教組。

2.方法

（1）孕鼠慢性疼痛模型的制備

慢性關節炎疼痛模型[5]：母鼠交配成功后當日（妊娠第0天），在七氟烷麻醉下，圍繞左后足足跖關節部選擇兩點皮內注射完全弗氏佐劑(complete Freund' s adjuvant, CFA) 100 μl (500 μg)，該注射可誘導產生慢性關節炎(chronic arthritis, CA)。在注射后的24 h（妊娠第1天，即疼痛造模第1天）即出現熱和機械痛覺閾值的降低并可維持4周以上，覆蓋母鼠整個孕期（22 d左右）及產后1周。分別在造模后第0、1、3、7、14、21、28 d，用熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。監測儀器：IITC series 8, IITC Co., LTD., USA）來評估疼痛，確保動物在各時間點處于相同疼痛水平。假手術對照組孕鼠用同樣麻醉方式、同樣注射方法、同樣注射部位注入同體積無菌PBS。

（2）飼養方式

常規飼養方案：單籠單只飼養，鼠籠周圍環境溫度23±1℃，相對濕度以50%～60%，食物充足，自由攝食飲水，晝夜均衡，直至分娩后3周。

優裕胎教飼養方案：將慢性疼痛+優裕胎教組孕鼠放置于寬敞的鼠籠中飼養，每籠1只。籠中擺放有云梯、滑繩等供孕鼠啃咬木頭，在常規飼養的基礎上還額外提供花生、葵花子、堅果等，同時將小鼠置于節奏舒緩的音樂中（6 h/d，音量控制在50～60分貝）[7]。

（3）痛相關遞質水平檢測

在母鼠孕第6 d、12 d、18 d、生產當日、產后6 d分別用ELISA法檢測其血清中5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)水平。

（4）孕鼠認知行為監測

Morris 水迷宮水30 cm深，室溫、水溫均保持在(25±1)℃。將水池分為4個象限，將無色透明的平臺固定在第3象限中央，位于水面下1 cm。攝像頭置于水池中央的上方約2 m處，自動采集小鼠游泳軌跡圖像信息并傳入計算機進行分析處理。本研究在給孕鼠造慢性疼痛模型后6～12 d用Morris水迷宮監測其認知行為狀況，其中定位航行實驗檢測其學習能力，空間搜索實驗檢測其記憶能力。

定位航行實驗：歷時6 d。訓練第1 d讓小鼠自由游泳以熟悉環境，上下午各1次，每次時間為60 s。從第2 d起正式檢測，每只小鼠測試4次/天，每次將小鼠面朝池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水至找到平臺的游泳軌跡及時間（逃避潛伏期，escape latency）。如小鼠在60 s內未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期計為60 s。取小鼠四次逃避潛伏期的算術平均數作為其當天的平均逃避潛伏期(average escape latency)。每次訓練完，用干毛巾將小鼠擦干（注意避免對其腹部的按壓和刺激），以防止低體溫造成的應激，讓小鼠休息60 s后開始下一次訓練。

空間搜索實驗：在定位航行試驗結束后撤除平臺，從第2象限將小鼠放入水中，記錄小鼠60 s內搜尋平臺的運動軌跡、在原平臺所在象限的停留時間和游程占總時間（時間比率）和總游程（游程比率）的百分比、平均游速和穿越原平臺區的次數。

3.統計學處理

實驗數據采用SPSS 23.0統計軟件分析處理。計量資料以均數±標準差(±SD)表示。多組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用事后檢驗LSD法（資料均符合正態性和方差齊性）。計數資料用百分比(%)表示，多組間比較采用卡方檢驗。按檢驗水準α = 0.05，當P＜ 0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1.慢性疼痛對孕鼠認知行為的影響

（1）慢性疼痛對孕鼠學習能力的影響：定位航行實驗結果顯示，從訓練第3天至第6天，與正常對照組、假手術對照組和慢疼＋優裕胎教組孕鼠相比，慢性疼痛組孕鼠平均逃避潛伏期均較長（P＜ 0.05，見圖1）。

（2）慢性疼痛對孕鼠記憶能力的影響（見表1）。

2.慢性疼痛對孕鼠神經遞質水平的影響（見圖2）

與假手術對照組相比，慢性疼痛組孕鼠在整個孕期與產后6天其外周血中5-HT與DA水平顯著降低（P＜ 0.05，見圖2A、2B）。與慢性疼痛組相比，慢疼＋優裕胎教組孕鼠在圍產期各時間點5-HT與DA水平顯著增高（P＜ 0.05，見圖2A、2B）。

討 論

慢性疼痛常伴有認知功能的改變，如慢性疼痛病人常主訴學習、記憶障礙，近80%的慢性疼痛病人認為自己學習記憶能力減退[8]。本研究在受孕小鼠慢性疼痛模型中發現，孕期慢性疼痛可導致孕鼠認知能力下降，優裕胎教可有效改善其認知能力。

當疼痛發生時，沖動信號通過丘腦部分傳遞到大腦皮層，并由中央后回（大腦負責疼痛感覺的區域）接收。其他沖動傳遞到腦干的網狀結構，大腦邊緣系統和廣泛的大腦皮層（包括額葉，頂葉和顳葉），它們進行綜合、分析信號，最終命令身體通過情緒活動和有意識的運動來應對疼痛[9]。在這些信號的傳導過程中，介導疼痛的遞質如5-HT、DA不僅參與疼痛的調控[10]，對學習記憶也有重要的調節作用[11]。5-HT通過軸突投射廣泛釋放到大腦中樞神經系統，調節大腦皮質的興奮狀態，參與人類的認知、情緒和運動等許多生理過程[12]。海馬中5-HT與認知功能密切相關，在海馬長時程效應增強和記憶改善中起重要作用，是維持智力的重要神經遞質[13]。DA 可以減少氧化應激損傷，增加腦部血流供應，改善腦部神經元利用葡萄糖，在突觸可塑性和學習記憶形成的調節系統中發揮重要作用[14]。本研究發現，伴隨認知能力的下降，慢性疼痛組孕鼠5-HT、DA遞質水平從孕6天開始逐漸降低，生產當日達到最低水平，產后有所增高。與假手術對照組相比，慢性疼痛組孕鼠5-HT、DA水平顯著降低。而優裕環境下飼養的慢性疼痛孕鼠，其認知能力與慢性疼痛組孕鼠相比有顯著改善，同時各時間點其5-HT、DA水平與慢性疼痛組孕鼠相比亦顯著增高。這提示5-HT和DA可能是慢性疼痛導致孕鼠認知能力下降的機制之一。

表1 各組孕鼠空間搜索能力比較 (n = 6,±SD)Table 1 Comparison of spatial search ability of pregnant mice in each group (n = 6,±SD)

表1 各組孕鼠空間搜索能力比較 (n = 6,±SD)Table 1 Comparison of spatial search ability of pregnant mice in each group (n = 6,±SD)

*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，與假手術對照組比較；△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，與慢性疼痛組比較*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, compared with the sham group; △ P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01, compared with the CP group.

穿越平臺次數Number of crossing the platform(times/60s)游速Swimming speed（cm/s）時間比率Time ratio(%)游程比率Distance ratio(%)正常對照組Normal 4.61±1.33 21.32±1.20 42.93±3.27 46.28±2.92假手術對照組Sham 4.69±1.69 22.17±1.99 41.64±3.36 43.53±3.59慢性疼痛組CP 1.24±1.35** 19.42±1.52* 25.33±3.83*** 26.69±2.67**慢疼+優裕胎教組CP + EEI 3.32±1.56△ 20.27±1.66 34.39±2.57△△ 36.82±3.39△△

圖2 (A)各組孕鼠在不同時間點5-HT水平的比較; (B)各組孕鼠在不同時間點DA水平的比較aP ＜ 0.05，與正常對照組比；bP ＜ 0.05，與假手術對照組比；cP ＜ 0.05，與慢性疼痛組比Fig.2 (A) Comparison of 5-HT level of pregnant mice in each group at different time points.(B) Comparison of DA level of pregnant mice in each group at different time points aP ＜ 0.05, compared with the normal group; bP ＜ 0.05, compared with the sham operation group; cP ＜ 0.05, compared with CP group.

本項目的完成揭示了妊娠期慢性疼痛對母體認知功能產生不利影響的機制并提供了干預策略，為臨床患有慢性疼痛的孕婦的無創、非藥物性干預提供了實踐依據，為改善分娩結局，提高出生人口素質，促進母嬰健康提供了有力支持。