Nav1.8在足底切口痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)的研究

劉 怡 孫嬌麗 李寧波 張咸偉

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢430030）

術(shù)后疼痛是最常見(jiàn)的一種急性疼痛。近年來(lái)，盡管臨床鎮(zhèn)痛技術(shù)不斷改善，仍然有39%～50%的手術(shù)病人經(jīng)歷中、重度術(shù)后疼痛[1]。術(shù)后疼痛發(fā)生率高、控制不佳，嚴(yán)重影響了病人的恢復(fù)及生活質(zhì)量，因此術(shù)后疼痛的防治仍然是臨床實(shí)踐中迫切需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。目前認(rèn)為術(shù)后疼痛機(jī)制中痛覺(jué)過(guò)敏是重要環(huán)節(jié)，敏化機(jī)制復(fù)雜，且敏化過(guò)程尚未明晰。

電壓門控鈉通道Nav1.8是河豚毒素不敏感(tetrodotoxin-resistant, TTX-R)鈉通道，主要在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)小直徑C纖維神經(jīng)元細(xì)胞上表達(dá)[2]。在疼痛信號(hào)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)過(guò)程中，DRG是機(jī)體疼痛電信號(hào)向脊髓及以上中樞傳遞的紐帶，Nav1.8產(chǎn)生慢失活TTX-R鈉電流，是其所在細(xì)胞動(dòng)作電位去極化期鈉電流的主要通道。研究發(fā)現(xiàn)在SNL、SNI、CCI及骨癌痛模型等多種疼痛模型中大鼠DRG神經(jīng)元中Nav1.8通道表達(dá)上調(diào)，TTX-R鈉電流明顯增加[3～7]，應(yīng)用高選擇性Nav1.8阻滯劑可依賴性阻滯SNL、SNI、CCI引起的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏[7]，且選擇性敲除Nav1.8基因的大鼠會(huì)表現(xiàn)出對(duì)機(jī)械性刺激的痛覺(jué)缺失[5]。因此，我們推測(cè)Nav1.8或與術(shù)后痛覺(jué)敏化過(guò)程有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)足底切口痛模型大鼠術(shù)后2 h、1 d、2 d、3 d、5 d的行為學(xué)變化及L4-L6節(jié)段DRG內(nèi)Nav1.8 mRNA和Nav1.8蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，來(lái)探究Nav1.8表達(dá)在切口痛誘發(fā)的痛覺(jué)敏化過(guò)程中的作用，為急性術(shù)后疼痛的防治提供理論依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年雄性SD大鼠36只，體重200～250 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境：12小時(shí)晝夜周期，室溫20～25℃，濕度60%～70%，分籠飼養(yǎng)，通風(fēng)良好，避免強(qiáng)光及噪聲，自由進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)前靜養(yǎng) 1周，使其習(xí)慣該環(huán)境，避免環(huán)境對(duì)痛閾值測(cè)量的影響。隨機(jī)編號(hào)分組為空白對(duì)照組 (oh組，n= 6) 和足底切口痛組(n= 30)，其中足底切口痛組包括2 h組（n= 6，足底切口痛模型手術(shù)后2 h處死）、1 d組（n= 6，術(shù)后第1天處死）、2 d組（n= 6，術(shù)后第2 d處死）、3 d組（n= 6，術(shù)后第3天處死）和5 d組（n= 6，術(shù)后第5 d處死）。分別接受疼痛行為學(xué)測(cè)量，并且在每個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，從空白對(duì)照組和模型手術(shù)后組取大鼠左側(cè)L4-L6DRG進(jìn)行PCR檢測(cè)(n= 3)和Western Blotting檢測(cè)(n= 3)。

2.足底切口痛模型的建立

根據(jù)Brennan 研究組方法[8]建立足底切口痛模型。大鼠用4%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，之后改為2.5%的異氟烷維持麻醉。碘伏消毒大鼠左后足皮膚后，從距離足跟 0.5 cm 處向足趾方向做一長(zhǎng)約 1 cm 的切口，分離暴露足底肌肉并縱行切開(kāi)，保持肌肉完整性。壓迫止血，用3-0線縫合皮膚 2 針，術(shù)后傷口處涂抹青霉素粉，整個(gè)手術(shù)過(guò)程約為 5 min?？瞻讓?duì)照組不作處理。

3.疼痛行為學(xué)測(cè)量

（1）機(jī)械性縮爪閾值(Mechanical withdrawal threshold, MWT)

將大鼠置于底部為網(wǎng)格狀的塑料測(cè)痛籠中，適應(yīng)環(huán)境30 min。依照Vivancos方法[9]，利用電子von Frey纖維絲(UGO BASILE Cat.38450)進(jìn)行機(jī)械性疼痛敏感性測(cè)試。將纖維絲尖端垂直施加壓力，作用于大鼠左足底中部，當(dāng)后足迅速撤回時(shí)，壓力被自動(dòng)記錄。重復(fù)測(cè)試，直至三次測(cè)量值相近（10 g以內(nèi)），測(cè)試間隔時(shí)間為10 min，三次測(cè)量的平均值即為機(jī)械性縮爪閾值。

（2）熱刺激縮足反射潛伏期(Thermal withdrawal latency, TWL)

將大鼠置于熱痛測(cè)試設(shè)備中，適應(yīng)環(huán)境30 min。根據(jù)Hargreaves等人的方法[10]進(jìn)行熱痛覺(jué)敏化測(cè)試。熱痛刺激儀(UGO BASILE S.R.L 37370)的輻射熱源透過(guò)熱板集中照射左后足掌心處，大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)（抬起或舔后爪）時(shí)自動(dòng)切斷并記錄從照射開(kāi)始到縮足反應(yīng)的時(shí)間，重復(fù)測(cè)量三次，每次間隔5 min，三次重復(fù)測(cè)量的平均值為熱刺激縮足反射潛伏期。為避免組織損傷，熱痛刺激儀自動(dòng)切斷時(shí)間為20 s。

4.實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR, q-PCR)檢測(cè)Nav1.8mRNA在大鼠DRG中的表達(dá)

大鼠于術(shù)后2 h、1 d、2 d、3 d、5 d測(cè)痛后，深麻醉下分離左側(cè)L4-L6DRG組織，以Trizol法提取DRG總RNA，測(cè)定各組RNA樣本的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間滿足實(shí)驗(yàn)要求。取2 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7900 / illumina eco，7900 Viia7)行PCR。以GAPDH為內(nèi)參，樣本包含3個(gè)復(fù)孔，以2-△△Ct分析Nav1.8 mRNA的表達(dá)水平。擴(kuò)增條件如下：50℃ 2 min，95℃10 min；95℃ 30 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：Nav1.8（正向）：5’-CGACGATGGTGAATAACAAG-3’，（反向）：5’-GAAAACGACGAAGTACAGGT-3’；GAPDH（正向）：5’- ACAGCAACAGGGTGGTGGAC -3’，（反向）：5’- TTTGAGGGTGCAGCGAACTT -3’。

5.蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）檢測(cè)Nav1.8 蛋白在大鼠DRG中的表達(dá)水平

大鼠于術(shù)后2 h、1 d、2 d、3 d、5 d測(cè)痛后，深麻醉下分離左側(cè)L4-L6DRG組織，向DRG組織中加入RIPA裂解緩沖液（碧云天P0013B），冰浴研磨器充分研磨裂解，提取DRG中總蛋白，使用碧云天試劑盒(P0010)檢測(cè)樣品蛋白濃度，蛋白變性后保存至-20℃?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg蛋白樣品于SDSPAGE凝膠系統(tǒng)上樣電泳，半干轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉/TBST 20 ml，室溫?fù)u床封閉2 h。加入兔Anti-Nav1.8一抗(1:200，Alomone ASC-016)、兔多抗GADPH（1:1 000，杭州賢至生物有限公司AB-P-R 001），4℃孵育過(guò)夜。第2 d加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（1:50 000，武漢博士德生物工程有限公司BA1054）， 37℃搖床孵育2 h。加入TBST緩沖液充分洗滌PVDF膜，于暗室內(nèi)膜上滴加ECL工作液（Thermo，NCI5079）反應(yīng)數(shù)分鐘待熒光帶明顯后，X光膠片壓片，依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗、晾干、掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖形用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行繪制，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，q-PCR、Western blotting數(shù)據(jù)組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間疼痛行為學(xué)比較采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）進(jìn)行比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.足底切口痛模型手術(shù)后，大鼠疼痛行為學(xué)改變

大鼠足底切口痛模型建立成功，與空白對(duì)照組比較，足底切口痛組大鼠術(shù)后2 h至術(shù)后第5 d MWT明顯下降(P＜ 0.05)，且于術(shù)后2 h MWT降到最低（見(jiàn)圖1A）。足底切口痛模型大鼠術(shù)后TWT下降，與空白對(duì)照組比較，術(shù)后2 h降至最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)，從術(shù)后第1 d至術(shù)后第5 d開(kāi)始出現(xiàn)恢復(fù)，盡管大鼠疼痛閾值仍然低于對(duì)照組，但是沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05，見(jiàn)圖1B）。

2.足底切口痛模型手術(shù)后，大鼠DRG內(nèi)Nav1.8表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

在術(shù)前（0 h）及足底切口疼痛模型手術(shù)術(shù)后2 h、1 d、2 d、3 d及5 d疼痛行為學(xué)檢測(cè)后取大鼠L4-L6DRG組織進(jìn)行q-PCR和Western blotting檢測(cè)大鼠DRG內(nèi)Nav1.8動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，足底切口痛模型大鼠Nav1.8 mRNA及Nav1.8蛋白在術(shù)后2 h表達(dá)水平最高(P＜0.05)，隨后Nav1.8表達(dá)逐漸恢復(fù)，雖表達(dá)量仍高于空白組，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，見(jiàn)圖2）。

討 論

圖1 足底切口痛大鼠模型術(shù)后疼痛行為學(xué)變化 (±SD)(A)機(jī)械性縮爪閾值；(B)熱刺激縮足反射潛伏期*P ＜ 0.05，與對(duì)照組相比Fig.1 Pain-related behavior in rats following plantar incision (±SD)(A) Mechanical latency withrawal threshold; (B)Thermal withdrawal latency*P ＜ 0.05, compared to the control group.

圖2 足底切口痛大鼠模型術(shù)后DRG內(nèi)Nav1.8動(dòng)態(tài)表達(dá)(±SD)(A) q-PCR檢測(cè)大鼠DRG內(nèi)Nav1.8mRNA表達(dá)變化；(B) Western blotting檢測(cè)足底切口痛大鼠模型術(shù)后大鼠DRG內(nèi)Nav1.8蛋白表達(dá)變化；(C)足底切口痛大鼠模型術(shù)后大鼠DRG內(nèi)Nav1.8蛋白定量分析 *P ＜ 0.05，與對(duì)照組相比Fig.2 Dynamic expression of Nav1.8 in DRG of rats after plantar incision (±SD)(A) Quantitative analysis of Nav1.8 mRNA expression in the DRG after plantar incision; (B) The expression of Nav1.8 in the DRG was analyzed by western blotting; (C) Quantitative analysis of Nav1.8 protein expression in the DRG after plantar incision.*P ＜ 0.05, compared with control.

大鼠足底切口痛模型是模擬人類術(shù)后疼痛的可靠動(dòng)物模型，有助于了解術(shù)后疼痛的發(fā)生機(jī)制，探索術(shù)后疼痛防治新方法。術(shù)后疼痛是臨床最常見(jiàn)的急性疼痛，在臨床實(shí)踐中，術(shù)后疼痛包括靜息痛和運(yùn)動(dòng)痛。本實(shí)驗(yàn)采用電子von Frey纖維絲定量機(jī)械性疼痛閾值，用熱刺激縮足反射潛伏期定量熱疼痛閾值，這兩種疼痛感覺(jué)均類似于臨床人類咳嗽誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)痛。本研究的疼痛行為學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示切口痛模型組大鼠于術(shù)后出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏，于術(shù)后2 h MWT和TWL降至最低，術(shù)后第1 d至5 d痛覺(jué)敏化逐漸恢復(fù)；PCR和WB結(jié)果顯示切口痛模型組Nav1.8 mRNA及Nav1.8蛋白在術(shù)后2 h表達(dá)水平升高，這與何小妹等人發(fā)現(xiàn)切口痛模型術(shù)后2小時(shí)Nav1.8表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致[11]。術(shù)后第1 d至第5 d Nav1.8表達(dá)開(kāi)始逐漸恢復(fù)。Nav1.8 mRNA及蛋白表達(dá)于術(shù)后2 h同時(shí)升至最高，這提示強(qiáng)烈的足底切口疼痛刺激信號(hào)傳入引起的Nav1.8表達(dá)量的變化可能出現(xiàn)在更早時(shí)候。細(xì)胞膜上Nav1.8的表達(dá)是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌控制的，受多種炎性或致炎因子的調(diào)節(jié)，如組胺可以通過(guò) H2受體通路上調(diào)初級(jí)傳入神經(jīng)元中Nav1.8 的表達(dá)從而導(dǎo)致神經(jīng)病理性痛等，腫瘤壞死因子α能上調(diào) Nav1.8 的表達(dá)[6]。最新研究表明足底切口痛模型大鼠DRG內(nèi)腫瘤壞死因子α表達(dá)上調(diào)[12]，這可能是引起Nav1.8表達(dá)上調(diào)的機(jī)制之一。

電壓門控鈉通道Nav1.8 主要表達(dá)于 89% C、93% Aδ、 60% Aα/β 傳入神經(jīng)元和 88%C 無(wú)反應(yīng)神經(jīng)元[13]，其編碼基因?yàn)镾CN10A。本課題組此前的電生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn) SCN10A常見(jiàn)突變 rs6795970 參與了非病理情況下 DRG 神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)[14]。Nav1.8是產(chǎn)生細(xì)胞動(dòng)作電位去極化期鈉電流的最重要通道，參與組織或神經(jīng)損傷后DRG神經(jīng)元自發(fā)動(dòng)作電位和異常高頻放電等異常電活動(dòng)，在外周神經(jīng)的敏化過(guò)程中具有重要意義[15]。DRG內(nèi)Nav1.8的持續(xù)上調(diào)可引起DRG神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，在疼痛信號(hào)的產(chǎn)生及傳導(dǎo)過(guò)程中以及外周疼痛信號(hào)向脊髓的傳遞發(fā)揮重要作用。切口痛模型手術(shù)后，DRG內(nèi)Nav1.8表達(dá)增加意味著DRG神經(jīng)元興奮性增加，DRG向脊髓背角釋放遞質(zhì)增加，進(jìn)一步向中樞傳遞的疼痛信號(hào)增加，最終導(dǎo)致痛覺(jué)敏化。本研究中術(shù)后2 h痛覺(jué)敏化最明顯時(shí)，Nav1.8表達(dá)水平最高；術(shù)后第1 d至術(shù)后第5 d痛覺(jué)敏化逐漸恢復(fù)時(shí)，Nav1.8表達(dá)水平也逐漸下降，足底切口痛模型大鼠術(shù)后5 d內(nèi)的痛覺(jué)過(guò)敏過(guò)程與DRG內(nèi)Nav1.8表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致。這表明Nav1.8參與急性術(shù)后疼痛的痛覺(jué)敏化過(guò)程，可能在急性術(shù)后疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究中足底切口痛大鼠熱痛閾值的變化與Nav1.8表達(dá)變化一致，術(shù)后2 h熱痛閾值降至最低時(shí)，Nav1.8 mRNA及Nav1.8蛋白表達(dá)量最高；術(shù)后1 d至術(shù)后5 d熱痛閾值出現(xiàn)恢復(fù)，與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，Nav1.8 mRNA及Nav1.8蛋白表達(dá)量與空白組比較差異也不明顯，而此時(shí)間段內(nèi)大鼠機(jī)械痛閾值與空白組比較仍具有差異，有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Nav 1.8阻滯劑可部分減輕切口痛組大鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏[10]，這提示足底切口痛模型的熱痛覺(jué)敏感性與Nav1.8更相關(guān)，而機(jī)械性痛覺(jué)敏感性的變化除受Nav1.8表達(dá)的影響，可能還受其他因素的影響。

本實(shí)驗(yàn)充分觀察了術(shù)后2 h后至術(shù)后5 d內(nèi)的痛覺(jué)敏化過(guò)程與DRG內(nèi)Nav1.8的表達(dá)情況，證實(shí)Nav1.8參與切口痛模型大鼠術(shù)后痛覺(jué)敏化的整個(gè)過(guò)程。但本實(shí)驗(yàn)存在一定局限性，并未明確使用Nav1.8抑制劑是否能減輕切口痛模型大鼠的痛覺(jué)敏化。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步驗(yàn)證Nav1.8抑制劑在此模型中的作用，研究Nav1.8在急性術(shù)后疼痛痛覺(jué)敏化中的作用。

綜上所述，足底切口痛模型大鼠術(shù)后2 h后至術(shù)后5 d內(nèi)的痛覺(jué)敏化過(guò)程與DRG內(nèi)Nav1.8的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致，提示Nav1.8參與急性術(shù)后痛覺(jué)敏化的形成與維持過(guò)程，可能在急性術(shù)后疼痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；大鼠熱痛閾值的變化與Nav1.8表達(dá)變化一致，切口痛模型的熱痛覺(jué)敏感性與Nav1.8更相關(guān)。本研究為術(shù)后痛覺(jué)敏化的機(jī)制提供新的補(bǔ)充，為完善術(shù)后痛覺(jué)敏化的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。