先天性心臟病遺傳學研究進展

汪希珂 綜述 田穎 審校

(貴州省人民醫院兒科心血管病區，貴州 貴陽 550002)

先天性心臟病(CHD，簡稱先心病)是胚胎時期心血管發育異常所致的心臟形態、結構和功能的異常。它是一類危害嬰幼兒生命健康的常見先天畸形，占嬰幼兒出生缺陷的首位，其發病率為活產嬰兒的6-8‰，死亡率在新生兒非感染性死亡中占首位約10‰[1]。先心病的病因尚不清楚，研究認為，遺傳和環境因素共同參與了先心病的發生。研究[2-3]發現，先心病存在家族聚集現象，家族成員患病危險度高于普通人群，并且與血緣關系遠近相關，血緣關系越近，患病率越高。因此，對先心病遺傳學發病機制的研究是目前國內外研究者聚焦的一大熱點。隨著人類基因組計劃的完成、分子生物學和遺傳學技術的發展，先心病分子遺傳學研究取得了一定的共識。研究認為先心病分子遺傳學機制復雜：單基因突變，多基因突變，染色體變異，基因組拷貝數變異都有可能導致心臟畸形的發生[4-5]。

1 基因突變與先天性心臟病

通過動物模型的胚胎期心臟發育學研究發現心臟畸形的發生與基因突變相關。進一步研究發現基因突變既可導致孤立型先心病，也可導致綜合征型先心病。目前，基因突變與先心病的研究主要通過對家系進行連鎖分析和對大量無直接親緣關系的個體或小家系進行連鎖不平衡分析兩種，通過從基因數據庫中找到與先心病發生相關的位點基因，然后檢測候選基因的突變位點，從而最終發現致病基因。近年來，通過先心病家系的研究定位了一些與心臟發育相關的致病基因，包括TBX5，NKX2.5，GATA4，ZIC3，MYH6，NOTCH1，CRELD1，FOG2，等[6-7]。通過在散發先心病患者中進行相關基因的突變篩查發現NKX2.5和GATA4基因突變可導致房(室)間隔缺損和房室傳導阻滯[8-9]。CRELD1突變導致孤立型(非綜合征)房室間隔缺損[13-14]，ZIC3突變導致伴有內臟反位的復雜性先心病[10]，GATA-4突變導致房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯癥等[11-12]，GATA-6突變導致永存動脈干、法洛四聯癥等圓錐動脈干畸形等[13-14]。截止目前，研究發現20多種致病基因突變導致散發或家族性孤立型先心病，而綜合征型先心病中發現的致病基因是孤立型先心病的兩倍多[5，15]。

雖然研究報道了越來越多參與調控心臟發育的基因突變與人類先心病發生相關，但對某個或某些基因突變是否引起先心病仍不能作出解釋。因為在散發先心病例中難以發現同樣的基因突變，即使在同一家系的不同成員中也可發生不同種類的心臟畸形。因此，其遺傳方式仍不明確，提示多基因參與調控的遺傳方式與環境相互作用的可能。

2 染色體異常與先天性心臟病

染色體異常主要包括非整倍體和微小缺失，是各種臨床綜合征最常見的病因。研究發現， 30%的染色體異常伴有心臟結構畸形[16]。通過染色體G 顯帶核型分析，可以檢測出大部分染色體非整倍體異常：如Down氏綜合征(21-三體綜合征)，18-三體綜合征，13-三體綜合征等。其中，約 50% 的Down氏綜合征伴發心臟間隔缺損，包括房間隔缺損，室間隔缺損和房室間隔缺損，80%的13-三體綜合征伴發內臟反位和心臟缺損；幾乎所有的18-三體綜合征都伴發以間隔缺損為主的先心病[17-18]。傳統染色體G 顯帶核型分析分辨率在5Mb 左右已在臨床診療工作中篩查出包括心臟畸形在內的各種綜合征，隨著細胞遺傳學技術的發展，分辨率更高的技術將用來分析染色體異常。

熒光原位雜交技術(FISH)是細胞遺傳學和分子遺傳學相結合的一種診斷技術。它是在原位雜交的基礎上，利用熒光染料標記特異寡聚核苷酸片段作為探針，與待檢測染色體DNA分子進行雜交，主要用于對染色體的定位。FISH技術的應用，大大提高了對染色體缺失和重復染色體異常的檢測靈敏度。其中，染色體缺失最典型的兩個病例是威廉姆斯綜合征和22qll.2微缺失綜合征。威廉姆斯綜合征是常染色體顯性遺傳疾病，主要表現為典型的面部特征，特殊心血管畸形，高鈣血癥，神經發育異常及骨路、腎臟發育畸形。心血管畸形主要為主動脈瓣上狹窄，肺動脈狹窄和外周肺動脈狹窄，約90%以上具有典型臨床表現的威廉姆斯綜合征患者可通過FISH檢測出來，其主要致病原因是染色體7qll.23區域基因的微缺失[19]。進一步研究發現7qll.23區域基因不同程度的缺失所導致的威廉姆斯綜合征臨床癥狀的嚴重程度也不盡相同，進一步研究在此區域發現了導致該類綜合征心血管發育異常的基因即彈性蛋白基因(Elastin)，該基因突變可導致主動脈或肺動脈的發育異常，同時，在散發主動脈瓣上狹窄患兒中也同樣發現該基因突變[20]。22qll.2缺失綜合征是一類由于染色體22qll.2發生微缺失而導致的疾病，包括DiGeorge綜合征，錐干面綜合征和腭心面綜合征，這類綜合征具有相同的遺傳基礎。包括典型的面容，腭裂，胸腺發育不全，心臟畸形及不同程度的認知、交流和發育障礙等。并發心臟畸形主要為法洛四聯癥，肺動脈閉鎖/室間隔缺損，永存動脈干，主動脈弓中斷等圓錐動脈干畸形[21]。

由于FISH 技術受探針特異性的限制，只能使用已知位點探針檢測已知的染色體異常，不能用于發現新的染色體異常，限制了其進一步應用。多重連接探針擴增技術(MLPA)是一種針對待檢DNA序列進行定性和半定量分析的技術，由Schouten等在2002年首先報道[22]。該技術也應用于人類基因片段的重復和缺失，MLPA能夠一次性對已知基因的所有外顯子進行缺失和重復的篩查，在臨床診療中，遺傳性疾病、腫瘤、出生缺陷和先心病都得到廣泛的應用[23-24]。但是，MLPA僅對已知的突變位點或區域的檢測，因此，需要有更為先進的技術進行染色體異常的檢測。

3 拷貝數變異與先天性心臟病

3.1拷貝數變異概念和發生機制 拷貝數變異(CNV)是由基因組發生重排而導致，它是指與參照基因組比較，長度為1 kb 以上的基因組大片段的缺失、插入、重復、倒位和復雜多位點的變異，主要表現為亞顯微水平的缺失和重復[25-26]。CNV廣泛存在于人類和其他哺乳動物的基因組中，是遺傳差異的重要起源。CNV 的形成依賴于重組和復制為基礎的機制，CNV 產生的機制主要有非等位基因同源重組(NAHR)，非同源末端連接(NHEJ)。CNV通過各種分子機制，包括基因劑量、基因斷裂、基因融合、位置效應等，導致了孟德爾遺傳規律性疾病，散在疾病或與其他復雜疾病的發生[27-28]。

3.2拷貝數變異檢測方法 目前，大多數CNV的研究是通過以下基因分析平臺來實現：微陣列比較基因組雜交技術(Array-CGH)、微陣列單核苷酸芯片技術(SNP-Array)和新一代測序技術。比較基因組雜交技術(CGH)是在FISH的基礎之上建立起來的，它是將目標待測基因組與正常對照基因組用兩種不同的熒光染料標記，按照相應的比例混合后與正常人染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察熒光強度，通過計算正常組和目標組的熒光比率確定目標基因組的DNA拷貝數的增減。

微陣列比較基因組技術(Array-CGH)由傳統CGH衍生，它將芯片技術利用在目標DNA基因組檢測上，將DNA克隆或者cDNA做成微陣列代替傳統CGH中的雜交靶，其分辨率較傳統CGH高出100倍以上，通過定位拷貝數變異精確的位置從而確定目標基因。目前，用于Array-CGH檢測的芯片探針主要是PCR擴增的BAC(細菌人工染色體)克隆和cDNA分子，較常用的是BAC克隆芯片，探針精度從最初的1Mb發展到目前應用的25bp。而SNP-Array芯片技術是在Array-CGH基礎之上利用新的遺傳標志—單核苷酸多態作為芯片發展而來的，通過比較目標基因DNA片段的信號強度與其他個體的強度，從而確定每個位點相對應的基因拷貝數目。SNP-Array與Array-CGH相比最大的區別是，SNP-Array芯片技術只需要目標基因組DNA片段與探針進行單雜交，而Array-CGH需同時對目標基因組DNA片段和參考基因組進行雜交。

同時，PCR技術是檢測目標基因組區域是否存在拷貝數變異的基本技術，實時定量PCR(real time qPCR)能很好的對拷貝數缺失和重復進行定量檢測，其準確率高。但是， qPCR 通常只能對一個區域進行檢測，近年來，應用的短熒光片段多重 PCR(QMPSF)、多重擴增探針雜交(MAPH)和多重連接探針擴增 (MLPA)等技術可同時檢測多達50個獨立區域，并且可以檢測傳統方法所不能檢測的所有外顯子缺失和重復。

此外，新一代測序技術和相應的實驗策略，如Paired-end mapping(PEM)與基于測序技術的深度檢測分析方法也可以發現CNV并對其進行精確定位[27，29-30]。但目前由于該技術因成本和可靠性等問題還商未解決，故未得以廣泛開展。但是，這一分析策略方法將是今后高通量CNV 分析方法的發展方向。

3.3拷貝數變異與先天性心臟病的研究 隨著基因芯片技術的發展，研究者對先心病相關致病基因及作用機制有了越來越多的發現和認識。由于先心病種類繁多，致病基因眾多，各種類型先心病與相關基因之間的聯系和通路機制尚不清楚，并且CNV在先心病中的研究非常有限。2007年，Thienpont等應用Array-CGH技術檢測了60例伴有心外畸形的綜合征型先心病患者，發現18例患者拷貝數變異，其患病率為30%；同時，在CNV缺失區域驗證了過去研究發現與先心病發生相關的致病基因NKX2.5，NOTCH1，NSD1 和EHMT[31]。Breckpot等研究報道了150例綜合征型先心病患者中43例發生CNV，其中26個CNV被確定為致病性CNV[5]，該研究組報道了綜合征性先心病CNV比與非綜合征型先心病CNV高，其比值是19%：3.6%。Richards 等對20 例染色體核型正常的綜合征型 CHD 患者的研究中發現5名患者存在致病性CNV[32]。Erdogan等對105例孤立型先心病應用BAC技術分析CNV，結果發現18個致病性CNV[33]。Greenway等對114例孤立性法洛四聯癥患者進行全基因組拷貝數分析研究發現11個新的CNV，對非綜合征孤立性TOF發現CNV在1q21.1，3p25.1，7p21.3 和 22q11.2等區域，基于上述結果的發現，該研究認為至少有10%的CNV是孤立性TOF的發生的病因[34]。另外，Fakhro等對262名內臟異位伴心臟畸形的患者及991名正常人進行了CNV研究，結果在內臟反位患者中發現了罕見CNV的增加，在這些CNV的獨特區域，研究者使用基因敲除方法在青蛙和非洲爪蟾進行了進一步的研究，結果定位NEK2，ROCK2，TCGBR2，GALNT11，和NUP188等5個基因在打亂了生物體左向右發展模式，最終導致內臟反位和心臟畸形[35]。Long Fei等對圓錐動脈干畸形家系進行CNV檢測發現8p23.1缺失，進一步研究發現在其8p23.1附近區域的SOX7基因重復，推測位于8號染色體的SOX7基因可能是在先心病發生的致病基因[36]。通過對基因組拷貝數變異在人類先心病中的研究，將有望尋找出新的致病基因，為易感基因的定位、克隆及基因表達的研究提供一定的理論基礎，可進一步揭示先心病的發病機制。

4 展 望

先心病遺傳機制異常復雜，目前的研究已證實單基因突變、多基因突變、染色體變異以及近幾年基于芯片技術的CNV均可能導致先心病的發生，提示遺傳因素是先心病重要發病機制。隨著CNV在先心病中的研究和新的發現，將促進對先心發病機制的認識和了解，同時，隨著將來更加先進和準確的基因檢測技術的出現，將有可能發現未知致病基因，這將進一步加深對先心病分子遺傳學機制的認識，為將來先心病的早期分子診斷、遺傳咨詢和治療開辟一條新的途徑。