肝癌免疫微環境及免疫治療最新進展

何其寬，葉志宇，陳曉崗

（寧波市第一醫院 普外科，浙江 寧波 315000）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為最常見的原發性肝癌（占70%～90%），據統計全球每年新增HCC至少有70萬例[1]，僅我國就占到了其中一半。HCC主要的致病因素包括有：乙肝病毒、丙肝病毒、飲酒、糖尿病及一些代謝性疾病[2]。目前臨床關于HCC的治療選擇，對于早期局部肝癌患者，可采用局部手術切除、肝移植、射頻消融及經動脈化療栓塞。由于早期無特異性表現，很多HCC患者在中晚期才能被確診。而對于中晚期肝癌，通常采用全身藥物治療以尋求手術機會，最具代表性的是抑制血管生成的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）：索拉菲尼、樂伐替尼、瑞格非尼[3]。然而，由于藥物耐受等原因，TKIs的治療效果有限[4]。肝臟是機體最大的免疫器官，內部存在各種免疫細胞，HCC作為典型的炎癥相關腫瘤，免疫耐受及逃避機制在癌癥進展中發揮著重要作用[5]。在腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中，癌細胞、細胞因子、免疫細胞、非腫瘤細胞和細胞外基質構成了一個動態系統，它們相互作用，產生生長因子、細胞因子和趨化因子來參與免疫抑制，從而促進肝癌細胞的進展[6]。其中，更有免疫抑制細胞通過分泌及信號轉導作用進一步驅動免疫逃避。在本文中，我們將闡述肝癌相關免疫抑制成分及潛在的免疫治療措施。

1 HCC腫瘤微環境中具有代表性的免疫抑制成分

1.1 骨髓來源抑制細胞（marrow-derived suppressor cells，MDSCs）

在HCC中，骨髓細胞分化為一組未成熟的髓樣細胞，具有很強的免疫抑制活性并影響抗原呈遞細胞功能[7]。MDSCs具有顯著的多樣性和可塑性，在不同環境中可以分化為巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等。MDSCs在肝癌TME中主要通過以下幾個途徑發揮免疫抑制作用：（1）誘導并擴增調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs），減輕效應T細胞功能；（2）抑制樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）與自然殺傷細胞（natural killer，NK）極化狀態，以及控制巨噬細胞向M2表型的轉變；（3）消耗T細胞必需氨基酸，誘導其凋亡；（4）誘發氧化應激反應。腫瘤來源的細胞因子（如G-CSF、GM-CSF、VEGF、MCP-1、IL-1β等）可以進一步誘導MDSCs的浸潤，其中肝臟內源性細胞周期相關激酶（cell cycle related kinase，CCRK）可以通過EZH2/NF-κB信號通路上調白介素6（IL-6）的產生[8]，誘導MDSCs在TME中聚集。同時，腫瘤細胞增殖期間造成局部缺氧狀態，可以進一步促進MDSCs的積累，缺氧誘導因子1α（HIF-1α）被證實能夠介導HCC細胞中CD39L1過表達以增加細胞外5’-AMP水平[9]，促進MDSCs進入TME。總之，由于MDSCs具有促進腫瘤及免疫抑制作用，可以將其作為HCC治療的特異性靶點，并為緩解HCC進展提供可能的輔助療法。

1.2 腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）

巨噬細胞起源于骨髓細胞來源的單核細胞，在不同環境刺激下巨噬細胞主要以M1和M2狀態存在。有研究證實，交替激活狀態的巨噬細胞可以刺激腫瘤的發生、發展及轉移[10]。此外，作為骨髓來源細胞，TAMs可以通過分泌細胞因子和趨化因子，抑制腫瘤免疫能力并促進腫瘤進展。在HCC中，一些特異性免疫抑制TAMs已經成為近年來的研究熱點。已知HCC來源的細胞因子如白介素4（IL-4）、白介素13（IL-13）、集落刺激因子1（CSF-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、結締組織生長因子等可以誘導相關炎性單核細胞分化為TAMs，或者激活巨噬細胞浸潤，進一步降低先天性免疫及后天適應性免疫。據報道，肝癌細胞可以分泌一種叫作骨橋蛋白的非膠原性骨基質糖蛋白，它與肝癌組織中PD-L1表達呈正相關，而且可以通過CSF1-CSF1受體途徑促進肝癌中TAMs選擇性活化以及趨化遷移[11]。MDSCs與TAMs之間相互作用可促進IL-10表達上升，IL-10作為一種強免疫抑制介質，能夠抑制下游CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒性作用。HCC中TAMs衍生的IL-10還可以增加腫瘤內Tregs的數量，從而抑制效應T細胞的活化。肝癌細胞周圍基質中的巨噬細胞可以分泌多種炎癥因子，其中IL-17可以介導CD4+T輔助細胞的擴增，后者可過表達多種腫瘤活化標志物來抑制抗腫瘤免疫作用[12]。TAMs還參與了其他免疫調節機制：轉化生長因子-β可以活化HCC中的TAMs，活化的TAMs通過NF-κB信號通路激活下游IL-6表達，促進腫瘤生長和免疫耐受，而IL-6/STAT3信號通路還被證實可以促進腫瘤干細胞來進一步維持HCC的發生[13]。

1.3 腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neutrophils，TANs）

作為骨髓分化來源的又一類細胞，TANs與MDSCs、TAMs對HCC進展都具有促進作用。此外，TANs不僅能夠促進腫瘤生長，還具有抗腫瘤生長作用。和巨噬細胞類似，TANs也可分為兩個細胞亞型，即N1亞型（抗腫瘤型）和N2亞型（促腫瘤型），分別通過腫瘤信號轉導通路來進一步發揮作用。TANs不同亞型的可塑性主要受轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的影響；TGF-β可以將TANs極化到N2表型，而抑制TGF-β與干擾素β（IFN-β）表達則可以誘導N1表型[14]。在腫瘤微環境中，TANs可以通過釋放細胞生長因子來促進或者抑制腫瘤的發展。研究發現，HCC細胞及其TANs可激活患者外周血中性粒細胞，從而分泌細胞因子趨化因子配體2（CCL2）和趨化因子配體17（CCL17）。CCL2、CCL17與腫瘤大小、微血管浸潤、腫瘤分化和分期等有關[15]。而且，CCL2和CCL17可以進一步促進HCC細胞、巨噬細胞和Tregs的遷移活性。綜上，TANs可將巨噬細胞和Tregs細胞募集到肝癌細胞中，促進HCC生長和進展。

1.4 調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）

Tregs主要來源于外周T淋巴細胞、常駐T細胞以及其他細胞來源。Tregs不僅可以限制機體自身免疫反應，還可以抑制機體對微生物和病毒抗原、過敏原、腫瘤以及同種異體移植物的反應。T細胞受體與IL-10及TGF-β結合，激活信號通路活化Tregs。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）也對Tregs的激活起到關鍵作用，其中過表達的長鏈非編碼表皮生長因子受體（lnc-EGFR）與EGFR結合后可阻止Tregs因泛素化作用而降解，從而促進Tregs在HCC中發揮免疫抑制作用[16]。在HCC患者中，Tregs的含量是顯著上升的，其與腫瘤細胞的侵襲性密切相關[17]。因此可以推測，Tregs的水平與HCC的進展有關，并有可能成為HCC一個可靠的預測指標或免疫治療的潛在靶點。

1.5 腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）

成纖維細胞與癌細胞之間的作用至關重要，它可以通過分泌各種生長因子及細胞因子來促進腫瘤的增殖、侵襲和遠處轉移；而這些與癌細胞相互聯系的成纖維細胞被稱之為CAFs。Kanto等[18]發現，骨形態發生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）在HCC腫瘤微環境中作為CAFs的主要功能調節器之一，其內源性或外源性的產生都可以促進肝臟CAFs分泌細胞因子，增強肝癌細胞侵襲能力。HCC來源的成纖維細胞通過滅活NK細胞，使得NK細胞在TME處于無反應狀態，從而為肝癌的進展提供了有利的條件。此外，CAFs還可以通過IL-6介導的STAT3信號通路激活并募集調節性DCs至TME中，而TME中分泌的TGF-β可以使其轉化為免疫耐受型DCs，并進一步上調Tregs的產生[19]。總之，CAFs在HCC細胞的發生發展中起著重要的作用，靶向抑制CAFs也有望能有效緩解甚至阻止HCC的進程。

1.6 腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）

腫瘤中高密度的TILs被認為是機體對癌細胞免疫反應的結果。早期臨床數據表明，肝癌患者術后高水平的淋巴細胞浸潤，尤其是T細胞浸潤可以有效降低復發率并提高患者生存率。但是，越來越多的證據證明，HCC患者中總的TILs浸潤程度并不能有效提高自身免疫來控制腫瘤的進展。肝內免疫反應涉及到不同的淋巴細胞亞群，它們對HCC的免疫檢測能力不同。其中最典型的就是Tregs與細胞毒性T細胞，兩者之間的差異將決定TILs對HCC所起到的免疫作用[20]。

2 現階段HCC免疫治療策略

2.1 免疫節點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）

ICIs是一種特殊的膜結合分子，在腫瘤免疫逃避機制中起著重要的調節作用。在HCC中，最常見的ICIs包括程序性細胞死亡蛋白及其配體（PD-1，PD-L1）、細胞毒性T淋巴細胞蛋白4（CTLA-4）、淋巴細胞活化基因3蛋白（LAG-3）和含黏蛋白結構域分子3（Tim-3）。PD-1是調節CD4+、CD8+T細胞、B細胞和NK細胞表達的調節性免疫球蛋白，在維持T淋巴細胞的免疫耐受和抑制免疫細胞活性中起重要作用。在HCC中，循環系統和腫瘤內PD-1+CD8+T細胞的增加預示著術后復發及不良預后，多種細胞因子尤其是IFN-γ誘導癌細胞PD-L1的上調進而削弱機體抗腫瘤免疫力，促進HCC進展[21]。現階段臨床研究的PD-1抑制劑納武單抗（Nivolumab）、派姆單抗（Pembrolizumab）、度伐單抗（Durvalumab）在HCC中已被證實了有效的治療作用。CTLA-4是一種活化的T細胞表達的抑制性共受體，主要存在于Tregs上，其在控制CD4+T細胞功能中起著關鍵作用。在HCC中，CTLA-4可以抑制腫瘤相關抗原識別和分化的T細胞增殖，通過誘導Tregs的活性和IL-10的產生進一步介導免疫抑制作用。目前，CTLA-4的特異性抑制劑替西木單抗（Tremelimumab）在改善HCC患者生存時間上有著明顯的作用[22]。Tim-3是一種跨膜蛋白，可在分泌IFN-γ的Th1細胞、NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞上表達，它可與可溶性配體半乳糖凝集素9（Galectin-9）相互作用負性調節T細胞作用。LAG-3是免疫球蛋白超蛋白家族的成員之一，其以高親和力和II類MHC分子結合，從而抑制T細胞的共刺激作用，來達到促癌作用。現階段，有關Tim-3和LAG-3抑制劑在臨床上的治療價值還需要進一步闡明。

2.2 過繼細胞療法（adoptive cell transfer，ACT）

近年來，基于細胞的免疫療法在實體腫瘤治療中得到了一定的發展。其中，ACT為癌癥治療提供了有效而持久的抗腫瘤免疫能力。根據細胞類型，在HCC中使用的ACT療法分為兩種：一種是細胞因子誘導殺傷（cytokine-induced Killer，CIK）細胞療法，另一種是嵌合抗原受體修飾的T細胞（CAR-T）療法。CIK細胞是一系列T淋巴細胞的混合物，可以從外周單核細胞中獲取，且容易培養。與細胞毒性T淋巴細胞相比，由于沒有MHC限制，CIK細胞對腫瘤細胞具有更好的殺傷效果。CIK細胞還可以通過NKG2d配體相互作用，有效殺傷腫瘤干細胞，改善HCC患者生存時間。CIK細胞作為一種有效的ACT免疫療法，為HCC的治療提供了一種全新的選擇。然而，部分接受治療的患者存在“免疫疲勞”以及缺少足夠白細胞的情況[23]，這也是CIK細胞治療有待克服的一個缺陷。另一種ACT療法，是基于CAR-T，其在HCC治療中也具有一定療效。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC-3）是一類在肝癌細胞膜上的癌胚蛋白多糖，可以促進HCC的進展，且與HCC不良預后有關。研究表明，細胞毒性T細胞活性與靶細胞中GPC-3的表達呈正相關[24]，靶向GPC-3的CAR-T細胞為GPC-3+的HCC提供了新的免疫干預措施。基于ACT的治療為HCC的免疫治療提供了新的途徑。然而，在被廣泛用作臨床治療藥物前，它們在臨床的療效和腫瘤脫靶毒性仍需要進一步評估。

2.3 HCC非細胞免疫和溶瘤病毒免疫治療

隨著越來越多腫瘤相關抗原的鑒定，AFP、GPC-3、人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）等多種腫瘤抗原已被確定為HCC免疫治療的靶點。早期HCC-AFP疫苗在臨床試驗中可以檢測到短暫的免疫作用；從TERT衍生而來的一種16個氨基酸組成的多肽疫苗（GV1001）[25]，它可以結合多個人類白細胞抗原復合物II分子，從而抑制腫瘤活性；GPC-3相關的疫苗可誘導HCC抗腫瘤作用，并延長患者總體生存時間。除了這些經典的腫瘤相關抗原外，還有一個潛在的新靶點即睪丸癌相關抗原（cancer-testis antigens，CTAs）[26]，由于CTAs在多種腫瘤和正常組織中的表達模式受到了一定的限制，它被認為是HCC免疫治療的新靶點。溶瘤病毒可選擇性地在腫瘤細胞中復制，殺傷腫瘤細胞并特異性地在腫瘤組織中傳播，而不損傷正常細胞。對于HCC免疫治療的溶瘤病毒，有報道多種治療基因重組的溶瘤腺相關病毒（adenoassociated viruses，AAVs）可以在肝癌細胞中發揮特異性殺傷作用。另外還有一種重組的AAVs模型，即含有hTERT和TNF-α相關凋亡誘導配體基因的AAVs載體，它以肝癌細胞端粒酶為靶點發揮了特異的細胞毒性和凋亡作用，抑制HCC的生長。總的來說，非細胞疫苗及溶瘤病毒是有效的腫瘤治療藥物，這有助于進一步擴大HCC免疫治療的選擇。

3 結論

免疫耐受是導致HCC病死率居高不下、治療效果不佳、預后差等不良后果的主要原因之一。在HCC中，包括MDSCs、TAMs、TANs、Tregs、CAFs和TILs等在內的免疫抑制細胞是TME的重要組成成分，它們與癌細胞、細胞外基質等共同組成了腫瘤微環境，從而抑制了免疫細胞的抗腫瘤活性，對促進HCC生長和侵襲也發揮著重要的作用。這些免疫細胞的分化、成熟及功能的發揮還受到細胞因子及其它化學因子的調節。因此，我們迫切需要開發針對這些免疫抑制細胞的治療方法。本文也介紹了一系列相關的免疫療法，包括ICIs、ACT療法、非細胞免疫療法和溶瘤病毒免疫療法等。然而，很多免疫相關療法尚處于試驗階段，仍需要進一步的臨床驗證。總的來說，免疫治療有望成為治療HCC最有前景的方法之一，隨著不斷的研究探索，我們相信免疫治療還可以變得更加有效。