RFWD3在肝細胞癌中的表達及其臨床相關性研究

王維杰，金婉婉，潘潔，王立博，朱榮濤，李健，張弛弦，梁若鵬

（鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052，1.肝膽胰外科，2.急診科）

肝細胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占全球新增病例的50%以上，具有高侵襲性和高病死率的特點。盡管近年來HCC的治療取得了顯著進步，但肝癌切除術后5年復發率仍高達70%，且大多數患者于術后2年內復發[1-3]。我國是乙肝大國，每年約有35/10萬人因HCC死亡，僅次于肺癌[4]。盡管醫學研究不斷深入，但HCC的早期診斷率依然偏低，即使對早期的HCC行根治性切除，五年生存率也僅為60%左右[5-6]。

毛細血管擴張性共濟失調癥突變基因（ataxia telangiectasia-mutated，ATM）和共濟失調毛細血管擴張以及Rad3相關基因（ataxia telangiectasia-mutated and Rad-3 related，ATR）是DNA損傷反應中的兩個關鍵位點，ATM和ATR信號轉導依賴于中心支架蛋白（replication protein A，RPA）。近期的研究發現，RFWD3能介導RPA的泛素化，并通過作用于多重賴氨酸殘基參與到ATM/ATR通路，應對DNA損傷反應[7-9]，而DNA損傷反應異常是腫瘤發生發展的重要機制之一。目前RFWD3在HCC中的具體作用仍不明確，其表達情況及其與HCC預后的關系也尚不清楚，本研究旨在通過檢測HCC臨床標本中RFWD3的表達情況，并結合數據庫資源和臨床資料，探索RFWD3與HCC預后的相關性。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本和資料收集

本研究中所有標本均來源于2014年1月至2017年12月在鄭州大學第一附屬醫院肝膽胰外科接受HCC切除術的患者，且已于術前取得了患者的知情同意。入組標準：所有患者均為初次手術，且術前未進行放化療，無其他相關合并癥。標本切除后立即在-80 ℃環境中妥善保存，術后病理皆證實為HCC。隨機選取40對HCC組織及癌旁正常肝臟組織進行后續檢測，同時采集患者的性別、年齡、乙肝表面抗原表達、和腫瘤大小及分期等資料。

1.2 RT-PCR法測定RFWD3轉錄水平的表達

采用TRIzol（Invitrogen公司）提取組織總RNA，進而用分光光度計測定RNA濃度。利用逆轉錄試劑盒（Promega公司），依照說明書步驟將RNA逆轉錄成cDNA。之后利用qRT-PCR測定雙鏈DNA染料SYBR Green PCR Master Mixture（美國AB公司）。

1.3 Western blotting和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測RFWD3的表達

（1）Western blotting：將HCC組織和癌旁組織分別制成勻漿，提取蛋白質并采用分光光度計測定其濃度，分別計算標本的上樣量。利用SDS-PAGE分離，然后轉移至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜），再將膜放入用1×TBST配制的5%脫脂牛奶中，室溫下封閉2 h，之后棄牛奶加入一抗（1:400稀釋）和GAPDH（1:3 000稀釋），接著置于4 ℃搖床上孵育過夜，用1×TBST洗滌3次，于室溫下加入用辣根過氧化物酶標記的二抗（1:3 000稀釋），孵育2 h，再次用1×TBST洗滌3次后檢測抗原抗體的免疫反應活性。將上述步驟于相同條件下重復3次，結果取均值。（2）IHC：肝癌和癌旁組織常規脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。4 μm石蠟切片用于RFWD3免疫組化染色，光鏡下捕片、觀察并分析。

1.4 GEPIA數據庫分析

在GEPIA數據庫中檢索RFWD3在HCC以及癌旁正常肝組織中的生物學信息，計算RFWD3的表達量，分析其與HCC總生存率和無瘤生存期的相關性。

1.5 統計學分析

應用GraphPad-Prism（Windows version-5.0）軟件進行統計學分析。數據結果用（±s）表示，用Mann Whitneyt檢驗比較不同樣本之間的差異，采用Pearsonχ2檢驗分析臨床特征與RFWD3表達的相關性，以上結果均設定P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測各樣品中RFWD3基因轉錄水平的表達

運用RT-PCR技術檢測40例HCC組織及其癌旁組織中RFWD3的mRNA表達量，如圖1所示，RFWD3的mRNA在HCC組織中的相對表達水平為（1.19±0.11），在癌旁組織中的相對表達水平為（0.35±0.04）。與癌旁組織相比，HCC組織中RFWD3的mRNA表達顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.001）。

2.2 Western blotting和IHC檢測各樣品的RFWD3表達量和臨床相關性分析

圖1 40例HCC組織及其癌旁組織的RT-PCR顯示，與癌旁組織相比，RFWD3的mRNA在HCC組織中的表達顯著升高（P＜0.001）

運用Western blotting和IHC技術檢測40對HCC組織及其癌旁組織中RFWD3的表達量，如圖2所示，HCC組織及其癌旁組織中均有RFWD3表達，通過灰度值分析發現，與癌旁組織相比，HCC組織中RFWD3的表達顯著升高（P＜0.001），IHC染色進一步證實HCC癌組織中RFWD3陽性率顯著增加。

圖2 40例HCC組織及其癌旁組織的Western boltting和IHC顯示，與癌旁組織相比，RFWD3在HCC組織中的表達量顯著升高（P＜0.001）

臨床資料（表1）分析發現，RFWD3的表達情況與HCC腫瘤大小之間存在顯著相關性（P=0.033），然而與患者的性別、年齡、乙肝表面抗原表達情況和TNM分期之間無顯著相關性（P＞0.05）。

為消除抽樣誤差對研究結果的影響，我們從GEPIA數據庫中提取了部分關于RFWD3在HCC組織以及正常肝組織中表達的數據[10]，分析結果顯示，與正常肝組織相比，RFWD3在HCC組織中的表達量顯著增高（圖3A），同時，在HCC患者中，RFWD3的高表達也伴隨著更低的總體生存率和無瘤生存期（P＜0.05） （圖3B和3C）。

3 討論

HCC是最常見的癌癥之一，具有高發病率、易轉移和預后差等特點，嚴重危害著人類的健康[11-13]。研究表明，HCC術后復發涉及腫瘤自身特征、手術相關因素及患者自身情況等諸多方面，早期復發多表現為局部浸潤、肝內播散和腫瘤自身生物學特征改變，晚期復發則主要表現為致癌因素如肝炎、肝硬化等導致的新發病灶形成[3]。為了更好地治療和預防HCC，目前已有很多研究試圖闡明其發生發展的分子機制，目前已知的HCC的發生發展與抑癌基因缺失、原癌基因激活、DNA甲基化、腫瘤的血管生成等多種因素密切相關，但主導因素并不明確。隨著分子生物學研究的不斷進展，現認為HCC是體內諸多生物信號轉導通路的相互作用下所產生的結果[14-15]。細胞的信號轉導通路通過一系列的正負反饋行為相互作用，從而調控細胞的復制、轉錄和翻譯等一系列生物學行為，影響著HCC的侵襲、轉移、耐藥和腫瘤的復發[16-18]。因此，探索HCC發生的關鍵調控基因，明確其信號轉導通路進而闡明其調控機制，對提高HCC的早期診斷率和改善患者預后有著極為重要的臨床意義。

RFWD3作為ATM/ATR的磷酸化底物作用于多重賴氨酸殘基，從而參與DNA損傷修復的過程[8，19-20]。查閱RFWD3相關研究發現，缺乏RFWD3表達可能會導致一系列疾病，尤其是惡性腫瘤的發生[19-20]。Fu等[21]學者率先報道RFWD3可與Mdm2形成RFWD3-Mdm2泛素酶復合物，從而正向調節P53的穩定性來應對DNA損傷修復。Elia和Feeney等學者的研究表明，在DNA損傷發生后，RFWD3在被停止的復制叉處聚積，與復制蛋白A （RPA）共同定位，并通過其WD40域在C端與RPA相結合，在同源重組之后促進復制叉的重新啟動[7]，同時促進RPA介導的DNA損傷反應[22]，而DNA損傷修復異常是腫瘤進展的重要機制之一。目前RFWD3的功能尚不明確，且無研究證實其在 HCC中的表達水平及與HCC患者預后的相關性。

表1 臨床資料參數和RFWD3表達相關性

我們首先利用RT-PCR技術，檢測了40例接受手術切除的HCC患者的癌及癌旁組織中RFWD3的mRNA表達量，結果顯示HCC標本中RFWD3的mRNA表達量明顯高于癌旁組織。同時，運用Western boltting和IHC技術，對40例HCC組織和癌旁組織進行RFWD3蛋白的定量檢測，從表達水平上得到了相同的結果。以上結果提示RFWD3基因的上調可能參與了HCC的發生發展。

此外，我們根據HCC組織和癌旁組織中RFWD3的表達情況，結合臨床資料，運用Pearson Chi-Squared檢驗分析RFWD3的表達量與HCC預后的關系，結果顯示HCC組織中RFWD3的高表達與腫瘤大小之間存在顯著相關，與腫瘤的TNM分期有正相關趨勢，但無統計學意義，提示RFWD3的高表達很可能是HCC的一個不良預后因素；與此相對應，HCC組織中RFWD3的表達量與患者的性別、年齡以及乙肝表面抗原表達情況之間無顯著相關性。以上結果提示RFWD3基因的上調可能參與了HCC的發生和發展，與HCC患者的預后密切相關。

圖3 GEPIA數據庫結果

鑒于本研究樣本量偏小，我們從GEPIA數據庫中提取大量HCC患者的數據來進一步驗證我們的結果，以減小抽樣誤差[10]。首先選取369例HCC組織和160例正常肝臟組織的數據，分析結果顯示RFWD3在HCC組織中的表達量顯著高于正常肝臟組織，該結果與我們的研究結果相互印證。之后我們又從HCC患者中分別選取RFWD3高表達和低表達數據各91例，分析結果顯示，RFWD3高表達的HCC患者總體生存率和無瘤生存期遠低于RFWD3低表達的患者，提示RFWD3的高表達是HCC的一個重要不良預后因素，這與我們的研究結果RFWD3高表達和HCC腫瘤大小呈成正相關這一結果也是一致的。因此，RFWD3基因的高表達可能參與了HCC的發生和發展，同時也可能是HCC一個重要的不良預后因素。

綜上所述，RFWD3基因的高表達可能是HCC一個重要的不良預后因素，以RFWD3這一功能基因為切入點，進一步揭示其介導HCC進展的生物學調控機制，將可能成為認識和探索HCC發病機制的一個新的研究方向，為HCC的臨床診治提供新的理論基礎。