免疫抑制治療對兒童重型再生障礙性貧血細胞因子表達的影響

陳 慧 劉 怡 馬 潔 高 超 邢天禹 趙曉曦 陳振萍

再生障礙性貧血(AA)是一種由多種原因引起的骨髓造血功能衰竭，導致全血細胞減少的臨床綜合征，包括遺傳性骨髓衰竭性疾病(IBMFS)和獲得性AA(aAA)。亞裔人群中約95% AA患者為aAA[1]。aAA分為繼發性(如藥物、放射損傷、病毒感染等所致)和特發性(無明確致病因素)[2]。目前認為T淋巴細胞異常活化、功能亢進造成的骨髓損傷在特發性aAA機制中占主要地位。在兒童中，重型AA(SAA)發病率高，起病急，進展迅速。抗胸腺細胞球蛋白(ATG)聯合環孢素的免疫抑制治療(IST)是缺乏人類白細胞抗原相合同胞供者SAA患兒首選的治療方案，緩解率60%～70%[2-4]。已有研究表明，aAA存在由免疫細胞及其分泌的細胞因子紊亂導致的免疫功能異常[5-7]。aAA與骨髓中造血干/祖細胞的免疫性損傷有關[8]。IFN-γ與TNF-α已被研究證實為主要的造血抑制因子[9-11]。此外，其他細胞因子，如白介素(IL)，在aAA的發生和發展過程中亦發揮重要作用[12-14]。本研究回顧性分析首都醫科大學附屬北京兒童醫院(我院)初診SAA患兒及其接受IST治療后的臨床資料，并與初診非重型AA(MAA)患兒的細胞因子水平進行比較，旨在探討血清細胞因子水平作為評價IST治療SAA療效的臨床意義。

1 方法

1.1 診斷與分型 AA的診斷及分型依據我國及英國血液學會標準[15,16]。①SAA：骨髓細胞增生程度<正常的25%；如≥正常的25%但<50%，則殘存的造血細胞應<30%。血常規需具備下列3項中的2項：中性粒細胞<0. 5 × 109·L-1、網織紅細胞<20 ×109·L-1、血小板<20 × 109·L-1；②極重型AA(VSAA)：中性粒細胞<0.2 × 109·L-1；③MAA：未達到SAA和VSAA診斷標準。根據染色體斷裂試驗、流式細胞儀檢測糖化磷脂酰肌醇(GPI)錨聯蛋白和細胞遺傳學檢查，除外IBMFS (如Fanconi貧血、先天性角化不良、Shwachman-Diamond綜合征、Diamond-Blackfan貧血和先天性無巨核細胞性血小板減少癥)、腫瘤性疾病(如低增生性白血病、淋巴瘤、惡性腫瘤骨髓轉移)、骨髓增生異常綜合征、原發性骨髓纖維化、溶血性疾病(如遺傳性溶血性貧血、自身免疫性溶血性貧血、陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥)及其他疾病(如肝病、營養性貧血、病毒感染、結締組織病)。

1.2 研究對象的納入和排除標準 ①SAA/VSAA組：納入2017年10月至2018年12月在我院住院初診為獲得性SAA/VSAA且應用IST治療的患兒。排除非首次使用ATG患兒。②MAA組：納入同期在我院住院初診為獲得性MAA并給予環孢素A(CsA)口服治療的患兒，除外輸注依賴型MAA患兒。

1.3 治療

1.3.1 成分輸血指征 當患兒Hb≤60 g·L-1，予輸注懸浮紅細胞；PLT≤10×109·L-1，予輸注PLT。

1.3.2 IST方案 在無感染、Hb輸至>80 g·L-1、PLT輸至>20 ×109·L-1情況下，入千級層流病房，予兔ATG(即復寧) 3.3 mg·kg-1·d-1，連續靜脈滴注5 d，每天在ATG前0.5 h開始予甲潑尼龍4 mg·kg-1·d-1靜脈滴注抑制ATG過敏反應，并持續伴隨ATG靜脈滴注直至結束。ATG治療結束后(第6 d)，激素開始逐漸減量(3周減停)，并予CsA持續口服(3～5 mg·kg-1·d-1，間隔12 h口服)，維持有效血藥谷濃度150～200 μg·L-1。CsA口服6個月無反應病例，則停用CsA，對癥成分輸血，并予造血干細胞移植治療；CsA口服12個月完全治療反應或部分治療反應患兒，12個月時CsA逐漸減量。ATG治療結束后，Hb<70 g·L-1者輸注RBC，PLT<10 × 109·L-1或感染、明顯出血時PLT<20 × 109·L-1者輸注PLT。粒細胞刺激因子(G-CSF)在ATG治療后2周開始使用，中性粒細胞>1.0 ×109·L-1時停用。

1.4 隨訪及療效判定

1.4.1 隨訪計劃 患兒出院后定期門診隨訪，由門診隨訪醫生評估治療反應。開始治療后6個月內血常規每周檢查1次，治療6個月后血常規和肝腎功能至少每月檢查1次。免疫指標及骨髓形態和病理變化按治療開始后6個月、1年、2年、3年、5年和10年進行評估。隨訪時間截止至患兒最后一次門診就診時間，本研究隨訪日期截止至2019年6月1日。失訪患兒截止至最后一次就診時間。

1.4.2 療效判定 按照英國血液學會療效標準[15,16]。①完全緩解(CR)：停止依賴成分輸血，Hb正常(依據同年齡、同性別兒童)，中性粒細胞>1. 5 ×109·L-1，PLT>100 × 109·L-1。②部分緩解(PR)：脫離血制品輸注，血常規各項指標未達到SAA標準。③未緩解(NR)：未脫離血制品輸注，血常規各項指標仍達SAA標準。④治療有效：取得CR及PR定義為對治療有反應。⑤復發：由CR轉變為PR，或PR變為NR，即由非輸注依賴變為輸注依賴。

1.5 細胞因子測定 采用CBA法檢測兩組初診時、SAA/VSAA組治療6個月和12個月、MAA組治療6個月患兒血清中T淋巴細胞相關細胞因子的表達水平。清晨空腹經靜脈抽取患兒外周血5 mL至促凝管，以150 g速度離心5 min后取上清液200 μL置于EP管。按人Th1/Th2亞群檢測試劑盒(江西諾德醫療器械有限公司，流式熒光法)說明書處理標本，應用標準品制作標準曲線；將捕獲免疫微球和血清樣本混合重懸，再與PE標記的熒光檢測試劑結合，在BD FACSCalibur流式細胞儀上獲取細胞。將上述采集到的數據經BD CBA FCAP分析軟件處理，通過分析雙抗夾心復合物的熒光強度，得到待測樣本相關細胞因子含量。

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析。非正態分布計量資料以中位數表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 SAA/VSAA組25例，其中男15例，女10例，SAA 16例，VSAA 9例，中位年齡96個月(2～15歲)。MAA組37例，其中男20例，女17例，中位年齡132個月(2～15歲)。兩組患兒性別和年齡差異均無統計學意義(P>0.05)。所有患兒無HLA相合同胞供者或不適于一線接受異基因造血干細胞移植。

2.2 細胞因子水平 表1顯示，初診時，SAA/VSAA組IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10濃度中位數均高于MAA組，IFN-γ和IL-6在兩組間差異均有統計學意義(P均<0.05)，TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10水平在兩組間差異均無統計學意義(P均>0.05)。

SAA/VSAA組經IST治療6個月后，外周血IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10濃度均有不同程度降低，以IFN-γ、TNF-α和IL-6水平下降最明顯。經IST治療1年后，IFN-γ和IL-6水平與治療前差異有統計學意義。

表1 MAA組和SAA/VSAA組治療前后細胞因子水平比較(中位數)

注P1：MAA組vsMAA組治療12個月；P2：SAA/VSAA組初診vsSAA/VSAA組治療6個月；P3：SAA/VSAA組初診vsSAA/VSAA組治療12個月；P4：兩組初診比較；P5：兩組治療12個月比較

2.3 IST療效 截至末次隨訪，SAA/VSAA組失訪3例，余22例全部生存，無復發，其中6例未到12個月復查時間。治療后6和12個月總體治療反應率均為100%(22/22，16/16)。IST治療6個月，獲得PR 14例(63.6%)，CR 8例(36.4%)；IST治療12個月，獲得PR 5例(31.2%)，CR 11例(68.8%)。

3 討論

aAA是由多種因素介導的骨髓造血衰竭性疾病，尤其是SAA和VSAA患兒出血和感染致死風險較高，預后較差。aAA的發病機制復雜，免疫介導的造血抑制近年來受到關注。造血的免疫調節因素包括各種細胞及其分泌的細胞因子之間的相互調節[5-8]，大多數aAA患者出現 T、B淋巴細胞亞群失衡，T細胞異常活化導致TNF-α與IFN-γ等造血負向調控因子水平增高，進而抑制骨髓造血功能。

T細胞根據分泌細胞因子的不同，可分為CD8+細胞毒性T細胞(CTL)和CD4+輔助性T細胞(Th)。已有研究證據表明，活化的CD8+CTL可釋放TNF-α和IFN-γ等造血負向調控因子，并通過 Fas/FasL信號通路誘導造血干/祖細胞凋亡[17]。另外，細胞因子是決定CD4+Th行駛功能的重要因素。Giannakoulas等[18]報道，在aAA中Th1克隆占優勢，分泌大量TNF-α和IFN-γ，進而抑制CD34+細胞造血集落的形成。正常情況下，機體的Th1/Th2類細胞因子趨于動態平衡，而在aAA患者機體中存在Th1的極化[9,19,20]。本研究顯示，初診SAA/VSAA患兒外周血TNF-α和IFN-γ的表達有不同程度升高，特別是IFN-γ水平，證實該疾病狀態下存在更嚴重的造血調控相關細胞因子失衡，造血負調控因子表達相應增加。

也有研究結果發現，aAA患者外周血與骨髓中Th17比例增多，同時伴隨 CD4+CD25+叉頭框蛋白(FOXP) 3+調節性T細胞(Treg)比例的減少，提示Th17與Treg比例存在負相關，免疫平衡被打破[21-24]。IL-6正是連接Treg與Th17分化的關鍵因子。TGF-β可誘導FOXP3表達，使初始CD4+細胞分化為Treg，但當有較高濃度的IL-6存在時，IL-6和TGF-β共同作用誘導轉錄因子RORγt表達，使初始CD4+細胞分化為Th17，而抑制其向Treg的分化[25,26]。由此可見，IL-6為Th17的分化提供了重要的細胞因子環境。除此以外，早前已有研究發現aAA患者CD8+CTL被激活，增加的TNF-α和IFN-γ間接刺激IL-6分泌，IL-6反過來作用于CTL，并能放大CTL的細胞毒作用[27]。本研究顯示，初診SAA/VSAA患兒外周血IL-6濃度顯著增加，參與了aAA的發病。

SAA、VSAA以及輸血依賴型MAA患兒，如有合適的骨髓造血干細胞供者，首選造血干細胞移植，療效好、復發和克隆性疾病遠期轉化風險小[2,28]。對于缺乏全相合同胞供體的患兒，近些年相關報道顯示應用IST治療后血液學反應率為60%～70%[2-4,29]，甚至IST治療后2年隨訪有效率可達80%，10年生存率可達90%[30,31]。因此，IST的療效值得肯定，是無合適骨髓造血干細胞供者SAA患兒的有效治療方法。本研究SAA/VSAA組在免疫抑制治療后，IFN-γ、TNF-α和IL-6水平明顯下調，療效評價證實IST療效佳；MAA組在口服CsA治療后，血清細胞因子變化不顯著，因此推測SAA/VSAA的發病更傾向于因T淋巴細胞過度活化，致使免疫失調，IST治療可以糾正失衡的T淋巴細胞亞群，降低造血負調控因子的表達水平，從而有助于骨髓造血功能的恢復和重建。

鑒于本研究為回顧性分析，且隨訪時間較短，樣本量相對較小，aAA的發病機制以及IST治療對于造血干/祖細胞作用機制、遠期安全性等一系列問題，尚需大樣本、長期的臨床試驗及基礎研究證實。