骨痹通方對骨關節炎大鼠基質金屬蛋白酶-3和Ⅱ型膠原酶的影響

杜夢夢 ，鄢澤然 ，陳穎穎 ，周 麗 ，陶慶文 ★

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院 中醫風濕病科，中日友好醫院 免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是由多種因素導致的以軟骨下骨破壞、關節軟骨變性、滑膜炎和關節邊緣骨贅形成為特征的慢性關節病變。據統計我國每年骨關節炎發病率約8.1%，隨著年齡增長，發病率也逐年上升[1]。骨關節炎常伴有關節腫脹、疼痛、僵硬、活動受限等癥狀。中藥在治療骨關節炎上有著很大的優勢，前期研究[2]發現骨痹通方改善膝骨關節炎患者關節疼痛、僵硬及活動困難程度等方面療效顯著。體外細胞實驗也證實骨痹通方可以抑制Wnt/β-catenin信號通路中Wnt5a、β-catenin的表達從而達到保護關節軟骨，抑制軟骨細胞凋亡的作用[3]。本實驗通過觀察骨痹通方調控Wnt/β-catenin信號通路影響大鼠膝骨關節炎基質金屬蛋白酶-3（matrix met alloproteinase-3，MMP-3）、Ⅱ型膠原酶（type Ⅱ collagenase，COL-Ⅱ）的表達，進一步探索骨痹通方保護關節軟骨的機制及具體作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用6周齡無特殊病原體級 （SPF級）雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠 35 只，體重 220～250g，中國藥品生物制品檢定所提供，動物許可證號：SCXK（京）2014-001，在中日友好臨床研究所清潔級動物室喂養。

主要試劑有逆轉錄試劑盒（批號：A3500），美國 Promega公司生產；Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（批號：QPK-201），日本 TOYOBO公司生產；引物合成由廣州復能Genecopoeia合成；Wnt5a（批號：ab174963）、β-catenin（批號：ab32572）、COL-Ⅱ （批號：ab34712）、MMP-3 （批號：ab53015）、β-actin （批號：ab8227）， 均由英國abcam公司生產；二抗（批號：ab6721），英國abcam公司生產。

鹽酸氨基葡萄糖膠囊，北京康必得藥業有限公司生產（批號：05170513）。

儀器有美國MJResearch基因擴增儀 （TTC-220）；Applied Biosystems PCR 儀（ABI7500）；BIORAD 電泳儀 （042BR03674）；BIO-RAD 酶標儀（721BR16681）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模

雄性SD大鼠35只隨機分為正常組、假手術組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組和骨痹通組，每組7只。空白組不干預，假手術組僅暴露膝關節不切斷韌帶，其余組均Hulth法造模。造模方法如下：將大鼠用10%水合氯醛麻醉后仰臥于手術臺上，無菌條件下取膝關節內側縱切口長約2cm，顯露膝關節，切斷前后交叉韌帶，取出內側半月板，然后雙層縫合傷口。術后予青霉素10萬IU/只腹腔注射1周，預防感染。

1.2.2 藥物制備

骨痹通方藥物組成：骨碎補20g、補骨脂15g、淫羊藿 15g、杜仲 30g、燙狗脊 30g、青風藤 30g、雞血藤30g、土貝母20g。均由中日友好醫院中藥房提供，由中日友好醫院制劑室進行藥物濃縮制備，使終濃度達到含生藥4g/ml。

1.2.3 藥物干預方法

正常組、假手術組和模型組給予3ml/只/d生理鹽水灌胃，鹽酸氨基葡萄糖組予0.065g/kg/d灌胃，骨痹通組用藥量按照人與大鼠體表面積等效劑量比值計算，予17g/kg/d灌胃。共灌胃6周。

1.2.4 取材

灌胃治療完成后，大鼠10%水合氯醛4ml/kg麻醉下，取手術側膝關節，低溫環境下提取膝關節軟骨，放置-80℃保存備用。

1.2.5 檢測方法與指標

表1 相關引物序列

表2 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因相對表達量

以每組5只樣本進行檢測。用軟骨RNA提取試劑盒提取軟骨中的RNA，用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，用 Real-time PCR儀檢測Wnt5a、βcatenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對基因表達量，相關引物序列詳見表1。

用RipA裂解液裂解軟骨組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，Western blot法檢測 Wnt5a、βcatenin、MMP-3、COL-Ⅱ的蛋白表達量。

1.3 統計學方法

應用SPSS22.0軟件進行統計學分析。滿足正態分布的數據，采用單因素ANOVA分析，2組間比較采用LSD法，對于分布非正態的數據，采用非參數檢驗。

圖1 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對蛋白表達量

2 結果

2.1 Real-time PCR結果

根據Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達結果，骨痹通方與正常組、模型組、鹽酸氨基葡糖組差異均有統計學意義（P＜0.05）。正常組與模型組差異有統計學意義（P＜0.05）。Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對基因表達量詳見表2。骨痹通方與正常組、模型組、鹽酸氨基葡糖組相比可以明顯抑制 Wnt5a、β-catenin、MMP-3 的基因表達（P＜0.05），促進 COL-Ⅱ的基因表達（P＜0.05）。模型組與正常組相比，可以顯著促進Wnt5a、βcatenin、MMP-3 的基因表達（P＜0.05），減少 COL-Ⅱ的基因表達（P＜0.05）。

2.2 Western blot結果

根據Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達（圖1）可知，骨痹通方與模型組、鹽酸氨基葡萄糖組相比，可以顯著抑制 Wnt5a、β-catenin、MMP-3的蛋白表達（P＜0.05），骨痹通組與正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組相比可以明顯促進COL-Ⅱ的蛋白表達（P＜0.05）。模型組、鹽酸氨基葡萄糖組與正常組相比，可以明顯促進 Wnt5a、βcatenin、MMP-3 的蛋白表達（P＜0.05），抑制 COL-Ⅱ的蛋白表達（P＜0.05）。 Wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的相對蛋白表達量詳見圖1。

3 討論

3.1 中醫認識“骨痹”及中藥干預Wnt/β-catenin信號通路的相關研究

骨關節炎在中醫屬“骨痹”范疇，痹病之名首見于《黃帝內經》，《素問·痹論》云：“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹。”《素問·痹論》提出“五臟皆有合，病久而不去者，內舍于其合也。故骨痹不已，復感于邪，內舍于腎”。可見，骨痹的發生與感受風寒濕邪有關，骨痹日久，累及于腎，腎氣不足則骨痹愈重，因此治療骨痹，當從補腎扶正論治，正氣足則可驅除外邪，疾病自愈。詹宏剛等人[4]用獨活寄生湯治療腎虛寒濕證膝骨關節炎，發現活寄生湯可以抑制 Wnt/β-catenin 信號通路中 Wnt5a、βcatenin、BMP-2mRNA表達，起到緩解骨關節炎疼痛的作用。肖志峰等人[5]通過模擬骨關節炎滑膜細胞實驗，發現補腎活血方能夠抑制β-catenin的表達，減少致炎因子MMP-7、COMP等的含量，保護關節滑膜，減輕骨關節損傷。這些研究從多方面證實補腎中藥可以顯著抑制Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白的表達，減少炎癥因子釋放，從而發揮對骨關節的保護作用。

3.2 Wnt/β-catenin信號通路及其對軟骨細胞凋亡的影響

研究顯示[6，7]，Wnt/β-catenin 信號通路是參與骨關節炎發生和發展的重要通路，影響骨關節炎軟骨細胞分化、增殖和凋亡。骨關節炎患者體內Wnt/β-catenin 信號通路呈激活狀態[8～10]，這主要是由于細胞外Wnt信號分子與細胞膜上特異性受體蛋白（frizzled）及輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP5/6）結合后形成Fz-LRP5/6復合物結合散亂蛋白（Dvl）促進LRP5/6磷酸化，促使軸蛋白（Axin）聚集到細胞膜抑制β-catenin磷酸化，穩定的β-catenin移位到細胞核，聯合T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）和聚集共激活劑，促使RNA轉錄和延伸。相反，當Wnt-Fz-LRP5/6受體復合物形成受阻，支架蛋白Axin和腺瘤性結腸息肉病蛋白（APC）形成β-catenin破壞復合物，該復合物通過CK1和糖原合酶激酶-3β（GSK3β）結合胞內β-catenin和促進β-catenin的有序磷酸化，被β-Trcp識別和泛素化，通過蛋白酶體引起凋亡[11]。MMPs是Wnt/β-catenin信號通路的下游基因，同時也是破壞關節軟骨細胞外基質（ECM）的主要酶類，當Wnt/β-catenin信號通路被激活后會促進MMPs的過表達[12]。基質金屬蛋白酶大致可分為6類，其中基質溶素酶（MMP-3、MMP-10及MMP-11）可以蛋白水解膠原等底物，造成基質損傷[13]。Ⅱ型膠原蛋白是軟骨基質的主要組成部分[14]。有研究表明[15]，當MMP-3過表達時會直接破壞關節軟骨結構，導致OA的發生。這可能是由于MMP-3表達量升高引起軟骨基質中Ⅱ型膠原蛋白的降解，最終導致軟骨破壞，加重骨關節炎。

3.3 骨痹通方通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮保護關節軟骨的作用

骨痹通方是首都國醫名師閻小萍教授治療骨關節炎的經驗方，方中骨碎補、補骨脂補肝腎、壯筋骨；淫羊藿、杜仲、狗脊補腎養溫陽作用較強，又兼有祛風除濕強筋骨功效；青風藤、雞血藤為藤類藥，性善走行，具有祛風除痹、舒筋活血作用；土貝母苦寒開泄，制約溫補藥藥性過于猛烈。本研究通過研究骨痹通方干預大鼠膝關節軟骨中wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因及蛋白表達量，發現經過骨痹通方干預的膝關節炎大鼠關節軟骨中的 wnt5a、β-catenin、MMP-3基因表達量較正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組明顯下降（P＜0.05），而正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組的Ⅱ型膠原酶的基因表達量較骨痹通組明顯下降（P＜0.05），模型組、鹽酸氨基葡萄糖組 wnt5a、βcatenin、MMP-3的蛋白表達量較正常組明顯升高，Ⅱ型膠原酶的表達量明顯下降（P＜0.05）。骨痹通組較模型組、鹽酸氨基葡萄糖組wnt5a、βcatenin、MMP-3的蛋白表達量顯著降低，Ⅱ型膠原酶的蛋白表達量較正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組明顯升高（P＜0.05）。鹽酸氨基葡萄糖組的wnt5a、β-catenin、MMP-3、COL-Ⅱ的基因及蛋白表達量與模型組差異無統計學意義 （P＞0.05）。表明骨痹通方與鹽酸氨基葡萄糖相比，在治療骨關節炎上療效更為顯著。骨痹通方可以抑制膝骨關節炎大鼠Wnt/β-catenin信號通路激活，減少MMP-3表達，抑制COL-Ⅱ降解，從而發揮對骨關節炎大鼠關節軟骨的保護作用。

根據本研究提出2點思考：（1）本研究初步證明骨痹通方對骨關節炎大鼠有治療作用，但最佳治療劑量有待進一步探索。（2）骨關節炎的發生機制復雜，與許多影響因素相關，Wnt/β-catenin信號通路只是骨關節炎發病機制中的一條，后期還需要大量研究發現骨關節炎發生的具體機制。