8周游泳運動對高脂飲食誘導胰島素抵抗大鼠骨骼肌細胞自噬的影響

李 恩，葉 魁，孫君志，蘇全生

胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是機體細胞無法對胰島素產生正常反應的一種病理狀態。骨骼肌是胰島素抵抗發生的主要部位之一[1]。細胞自噬，又稱“自體吞噬”，作為一種溶酶體依賴性降解途徑廣泛存在于真核生物內。細胞內蛋白質和細胞器出現衰老、損傷或變形時，細胞自噬被激活，自噬小體將其包裹吞噬并轉運至溶酶體進行消化降解。因而，適宜的自噬水平對于維持骨骼肌形態完整性非常重要[2]。

胰島素抵抗與細胞自噬密切相關。已有大量研究指出，長時間高脂飲食誘導的胰島素抵抗小鼠骨骼肌mTORC1活性顯著升高，細胞自噬水平明顯下降[3-5]。運動可明顯改變骨骼肌細胞自噬狀態[6]。Yan等發現，C57BL/6小鼠進行28天自主轉輪運動后，趾肌中細胞自噬標志蛋白Beclin-1、LC3-II和LC3-II/LC3-I分別增加了33%、43%和21%[7]，許多研究發現2～7天耐力運動可使骨骼肌細胞自噬活性程度出現明顯升高[8-9]。但尚未查到運動對胰島素抵抗骨骼肌細胞自噬影響的相關報道。以高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠模型為研究對象，觀察骨骼肌細胞的自噬情況和有氧運動干預對骨骼肌細胞自噬的影響，旨在為骨骼肌胰島素抵抗的運動治療提供理論依據和實踐指導。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

雄性Sprague-Dawley大鼠36只(6周齡，體重200±30 g，SPF級)，購于成都達碩生物科技有限公司(生產許可證號：SCXK(川)2015-30，合格證號：0000650)。飼養于成都體育學院運動醫學與健康研究所動物房。室內溫度控制在22～25℃，相對濕度40% ～70%，自然光照。用窗簾和燈光控制12：12h明暗循環，通風良好。

1.2 造模及分組

1.2.1 動物分組與胰島素抵抗模型建立

適應性飼養一周后，用SPSS 17.0將雄性SD大鼠36只隨機分為3組：正常飲食組(Normal Diet Group，ND， n=8)、高脂飲食組(High Fat Diet Group，HFD，n=12)和高脂飲食 +運動組(High Fat Diet+Exercise group， HFD+EXE， n=16)。

HFD和HFD+EXE組給予高脂飲食(普通飼料71.8%，豬油18%，膽固醇2%，蛋黃粉8%，膽酸鈉0.2%)飼養，8周后取血檢測空腹血糖、血清胰島素和胰島素抵抗指數判斷胰島素抵抗模型的建立；ND組正常飲食喂養。

1.2.2 運動方案

HFD+EXE組在實驗前先進行3天適應性游泳練習。正式運動干預時，以無負重游泳15 min開始，每天遞增10～20 min，經過1周增加至60 min，此后維持此運動量直至實驗結束，每周運動6天。大鼠游泳池規格：150 cm×60 cm×70 cm，水溫為30±2℃。必要時驅趕不游泳的大鼠以防其靜止漂浮。

1.3 樣本采集與指標檢測

1.3.1 樣本采集

禁食12小時后，2%戊巴比妥鈉溶液2.3 ml/kg腹腔注射麻醉，新潔爾滅消毒皮膚，以腹部正中切口打開腹腔，腹主動脈取血，離心血清備用；取腓腸肌置于4℃生理鹽水中反復漂洗后，濾紙吸干水分，部分組織置于3%戊二醛固定液中固定用于透射電鏡超微結構觀察；部分組織經液氮急凍后轉移至-80℃冰箱備用。

1.3.2 空腹血糖測試

大鼠禁食12 h后，尾靜脈取血，采用強生穩豪型血糖儀測量空腹血糖。

1.3.3 血清胰島素測定

禁食12 h，尾部靜脈取血后，離心分離血清，采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(96孔，Millipore，USA)檢測。操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，酶標儀(Bio-Tek，USA)450 nm波長依序測試各孔的吸光度(0D值)。

1.3.4 HOMA-IR指數的計算

胰島素抵抗指數(Homeostasis Model Assessment-IR Index，HOMA-IR)用于判斷胰島素抵抗水平變化。HOMA-IR指數越高，胰島素抵抗程度越嚴重。HOMA-IR指數=FBG*FINS/22.5。

1.3.5 骨骼肌超微結構檢測

每組選取3只大鼠同側腓腸肌，用3%戊二醛固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮酸逐級脫水，環氧樹脂812包埋，半薄切片光學定位，然后制成超薄切片，醋酸軸及枸櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型透射電鏡觀察并拍照。

1.3.6 蛋白免疫印跡

適量腓腸肌樣品置于預冷的組織裂解液(Lysis Buffer)中勻漿，冰上放置1 h使組織充分裂解，4°C，13 000 rpm離心1h后取上清，BCA法定量蛋白。樣品經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜上，封閉、孵育一抗(LC3-II，LC3-I， Beclin-1；abcam， USA)、孵育二抗、ECL 法顯影和曝光。Image-J圖像分析軟件進行條帶灰度分析。

1.4 數據分析

2 實驗結果

2.1 各組大鼠的基本情況

ND組大鼠精神狀態較好，進食與飲水正常，皮毛光澤且活潑好動；HFD組大鼠隨著高脂飲食的時間增長，精神狀態不佳，反應遲鈍、皮毛粗糙和蠟黃，多出現脫毛現象，尿量較ND組增多，大便稀薄，且在實驗過程中有4只大鼠出現嚴重感染(其中2只死亡)；HFD+EXE組大鼠精神狀態、反應速度、皮毛和二便情況與HFD組相比均有所改善，其中，造模過程中，3只大鼠嚴重感染死亡，游泳運動干預過程中有3只溺亡，2只未按預定運動方案完成全部運動干預被剔除。

排除試驗過程中感染死亡和未完成既定運動干預方案的大鼠后，ND、HFD和HFD+EXE組大鼠樣本量均為8只。

2.2 各組大鼠體重、FBG、FINS和HOMA-IR指數的變化

正式實驗開始時，各組大鼠體重無明顯差異(P＞0.05)。高脂飼料喂養8周，與 ND組相比，HFD和HFD+EXE組大鼠體重明顯升高(P＜0.05)。8周游泳運動干預后，HFD+EXE組大鼠體重較HFD組顯著性降低(P＜0.05)(圖1A)。

與ND組比較，HFD組大鼠FBG和HOMA-IR均明顯升高(P＜0.05)；FINS非常顯著性下降(P＜0.01)；而與HFD組相比，HFD+EXE組大鼠FBG和HOMA-IR出現明顯下降(P＜0.05)，FINS顯著上升(P ＜0.05)(圖1B、C、D)。

圖1 各組大鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數的變化(*P＜0.05，**P＜0.01)A各組大鼠體重的變化情況；B各組大鼠空腹血糖的變化情況；C各組大鼠空腹胰島素的變化情況；D各組大鼠胰島素抵抗指數的變化情況。Figure 1 The difference of Body weight(BW)，Fasting Blood Glucose(FBG)，Fasting Insulin(FINS)and HOMA-IR among the Normal Diet group(ND)，High Fat Diet group(HFD)and High Fat Diet+Exercise group(HFD+EXE)(*P＜0.05，**P＜0.01)A The changes of body weight after 8 weeks aerobic exercise training， B The changes of fasting blood glucose after 8 weeks aerobic exercise training， C The changes of fasting insulin after 8 weeks aerobic exercise training， D The changes of HOMA-IR after 8 weeks aerobic exercise training.

2.3 各組大鼠骨骼肌超微結構的變化

ND組肌纖維排列整齊，結構清晰；HFD組肌纖維排列較整齊，結構較清晰，線粒體出現明顯損傷，部分線粒體可見空泡變性；HFD+EXE組肌纖維排列整齊，結構清晰，胞漿內線粒體輕度損傷。但各組均未發現自噬小體(圖2)。

2.4 各組大鼠 LC3-II、LC3-I、LC3II/LC31 和 Beclin-1表達的變化

與ND組相比，HFD和 HFD+EXE組大鼠LC3-I未發生明顯變化(P ＞0.05)，LC3-II、LC3-II/LC3-I和Becline-1蛋白表達非常顯著性下降(P＜0.01)；與 HFD組相比，HFD+EXE組LC3-II/LC3-I和 Becline-1明顯升高(P＜0.05)，且LC3-II蛋白非常顯著性增加(P＜0.01)(圖3)。

圖2 各組大鼠骨骼肌超微結構變化情況(×10 000)Figure 2 The ultrastructure changes of skeletal muscle in rats in the Normal Diet group(ND)，High Fat Diet group(HFD)and High Fat Diet+Exercise group(HFD +EXE)(×10 000)

圖3 各組大鼠骨骼肌 LC3-II、LC3-I、LC3-II/LC3-I和Becline-1的蛋白表達變化(*P＜0.05，**P＜0.01)A各組大鼠骨骼肌LC3-I蛋白表達變化情況；B各組大鼠骨骼肌LC3-II蛋白表達變化情況；C各組大鼠骨骼肌LC3-II/LC3-I變化情況；D各組大鼠骨骼肌Becline-1蛋白表達變化情況Figure 3 The difference of LC3-II， LC3-I， LC3-II/LC3-I and Becline-1 among the Normal Diet group(ND)，High Fat Diet group(HFD)and High Fat Diet+Exercise group(HFD+EXE)(*P＜0.05，**P＜0.01)A The protein expression levels of LC3-II in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training，B The protein expression levels of LC3-I in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training，C The changes of LC3-II/LC3-I in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training，D The protein expression levels of Becline-1 in gastrocnemius after 8 weeks aerobic exercise training.

3 討論

3.1 有氧運動對IR大鼠血糖代謝和胰島素抵抗的影響

目前，胰島素抵抗的非藥物治療手段主要采用飲食控制和運動干預。運動可明顯減緩胰島素抵抗已有大量研究報道。齊潔等對高脂飼料誘導的胰島素抵抗SD大鼠進行為期8周的游泳運動干預后發現，無論是每天連續訓練90 min還是上午與下午各訓練45 min都能明顯降低胰島素抵抗，且二者之間無顯著性差異[10]。同時，許國喜等也指出，有氧運動可明顯提高胰島素抵抗大鼠骨骼肌IRS-1表達，且IRS-1磷酸化水平也明顯升高，胰島素抵抗現象明顯改善[11]。人體試驗方面，劉鷗等發現，有氧運動能夠明顯改善肥胖患者的HOMA-IR指數水平，并在一定程度上保護患者的胰島β細胞功能[12]。本實驗中，SD大鼠經8周高脂飲食喂養后出現明顯的胰島素抵抗現象，8周游泳運動可明顯降低胰島素抵抗大鼠空腹血糖，且使胰島素抵抗指數顯著下降，進而明顯改善骨骼肌胰島素抵抗狀態，和先前研究結果一致。

3.2 有氧運動對IR大鼠骨骼肌超微結構的影響

電子顯微鏡檢測是當今觀察細胞自噬形態學變化最直接、最經典的方法。Antonio等指出，用于檢測細胞自噬時，電子顯微鏡可觀察到細胞器的損傷情況、損傷細胞器周圍出現的空泡狀雙層膜結構及后續形成的自噬體結構[13]。

研究發現，有氧運動干預后，小鼠骨骼肌細胞出現了C形的雙層膜結構和少量的自噬小體[14-15]。本實驗結果顯示：ND組、HFD組和HFD+EXE組骨骼肌細胞未出現自噬小體，但其相應的自噬蛋白表達均明顯增加。可能原因有：⑴本實驗運動干預方式是無負重游泳運動，與負重的游泳運動或跑臺運動相比，運動強度相對較低；⑵運動通過能量需求的增加模擬饑餓刺激促進細胞自噬，但運動的同時給予大鼠高脂飲食，自噬現象可能會出現相互抵消，從而表現為不明顯或無特異性的變化；⑶運動干預時間較短(1 h/d)，對骨骼肌刺激作用較小；⑷AMPK是骨骼肌細胞重要的調節因子[16]，高脂飲食可抑制AMPK蛋白表達，抑制細胞自噬。

3.3 有氧運動對IR大鼠骨骼肌自噬相關蛋白表達的影響

自噬蛋白LC3是Atg8的同源物，可分為LC3-I和LC3-II兩種。LC3-II定位在雙層膜和自噬體上，是自噬體的特異性標志分子[16-18]，其含量和細胞自噬數量呈正比。同時，LC3-II/LC3-I比值與自噬泡的數量呈明顯正相關[19]，LC3-II/LC3-I比值大小是判斷自噬水平高低的依據。Beclin-1是自噬相關基因Atg6的同源物，不僅參與自噬體的形成過程，還有助于自噬體的成熟。Beclin-1一般不需要通過與 Bcl-2、mVps34、UVRAG、Bif-1、Barkor、Ambral等蛋白相互作用形成復合物就能發揮對細胞自噬的誘導作用[20]。

研究發現，小鼠進行高脂飲食飼養后，骨骼肌細胞LC3 mRNA表達顯著下降，p62 mRNA表達明顯上升，提示高脂飲食下骨骼肌細胞自噬水平下降[21]。Grumati等[22-23]研究發現C57BL/6小鼠一次性跑臺訓練1 h后，脛骨前肌LC3-II/LC3-I比值較對照組增加近4倍，提示一次性訓練后自噬蛋白表達增加有利于受損細胞內容物的清除，從而維持細胞的穩態。同時，有研究發現，營養性肥胖小鼠骨骼肌LC3mRNA和LC3-II/LC3-I比值下調，通過耐力運動和膳食的改善，能夠有效增加LC3-II的含量，緩解營養性肥胖機體細胞自噬水平的下降，從而使骨骼肌細胞自噬水平得以增加，維持細胞正常生理功能[24-25]。本實驗結果顯示：胰島素抵抗大鼠LC3-II蛋白表達和LC3-II/LC3-I比值均下調，提示隨著高脂飲食的持續喂養，骨骼肌細胞自噬水平不斷降低；8周游泳運動干預后，Beclin-1蛋白、LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值顯著上調，但并未達到空白對照組水平，提示適宜的運動訓練能有效提高骨骼肌細胞自噬水平，且不會造成細胞自噬的過度激活，從而對細胞內損傷的細胞器和代謝廢物進行清除。

運動強度可能是影響細胞自噬水平的重要因素。Feng等[26]研究指出，過度的運動訓練可使Beclin-1、LC3表達顯著升高，且肌肉出現萎縮，推測過度訓練引起細胞自噬的過度激活，導致過量降解骨骼肌細胞中的蛋白質，引發肌肉萎縮和收縮能力下降，細胞的免疫功能也隨之降低。Hussey等[27-28]也提出，自噬水平變化僅在一定程度上受能量消耗調控，且中低強度運動可誘導最佳自噬水平表達。本研究的無負重游泳運動干預結果也證實了這一點。中等運動強度耐力運動能有效上調Beclin-1、LC3-II和 LC3-II/LC3-I比值，增強骨骼肌細胞代謝能力；大強度長時間耐力運動會導致骨骼肌纖維受損，自噬體增多異常，Beclin-1、LC3出現過表達的現象，進而導致骨骼肌細胞受損。

4 結論

高脂飲食誘導胰島素抵抗大鼠骨骼肌細胞自噬水平顯著下降；有氧運動可明顯增加的骨骼肌自噬水平，進而對受損的骨骼肌產生一定的保護作用。