耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥機制研究及多位點序列分型

張雨晨，周樹生，王春艷，查 渝，曹曉光，黃 羽，王賢聰

鮑曼不動桿菌是院內重要的機會致病菌，尤其在ICU中常導致危重病人的感染[1-2]。碳青霉烯類抗生素一直被認為是治療各種感染的重要抗生素，然而近年來碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii,CRAB)分離株的比例卻在逐漸升高[3]。2016年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測顯示鮑曼不動桿菌占所有分離菌株的第三位[4]。2005年到2016年，我國鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐藥率從31.0%上升至68.6%，對美羅培南的耐藥率從39.0%上升至71.4%[4-5]。對碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌往往對其他常見的抗生素也同時耐藥，這使得臨床上治療CRAB變得更加困難。該研究通過收集ICU病區(qū)的CRAB探索鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制，同時進行多位點序列分型(MLST)探究其同源性，為院內爆發(fā)性感染進行預防控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌株來源收集2017年安徽省立醫(yī)院ICU病區(qū)患者標本分離的CRAB菌株共28株。同一患者同一部位分離的菌株不重復計入。

1.2實驗試劑主要試劑包括菌種保存管(北京友康恒業(yè)生物科技有限公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；2×Taq PCR Mix(上海近岸科技有限公司)；瓊脂糖(西班牙Biowest公司)；DNA分子量 Marker及Loading Buffer(6×)(日本TaKaRa公司)；K-B法藥敏紙片(英國OXOID公司)；E-test試紙條(溫州市康泰生物科技有限公司)；MH瓊脂平板(江門凱林貿易有限公司)。

1.3主要儀器主要儀器包括VITEK-2 COMPACT 全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)；PCR擴增儀(德國Biometra公司)；水平凝膠電泳儀(美國Bio-Red公司)；凝膠成像及分析系統(tǒng)(上海Biotop公司)；微量高速離心機(德國Sigma公司)；麥氏比濁儀(法國生物梅里埃公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.4菌株的鑒定與收集使用VITEK-2 COMPACT 全自動微生物分析儀進行菌株鑒定與藥敏試驗。質控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)。使用菌種保存管收集菌株，于-80 ℃冰箱保存。

1.5K-B紙片法及E-test法復測藥敏結果采用K-B紙片法或E-test法對CRAB進行體外藥敏。根據(jù)2017年美國CLSI標準判讀藥敏結果，耐藥表型見表1。

表1 鮑曼不動桿菌的耐藥表型(n=28)

1.6碳青霉烯酶表型篩查實驗參照文獻[6]報道的方法，采用碳青霉烯酶抑制實驗(CIM)檢測，若大腸埃希菌的生長未受到抑制，即無抑菌圈存在，則為產碳青霉烯酶的菌株；反之則為不產碳青霉烯酶的菌株。

1.7細菌基因組DNA的提取取菌株保存管的菌株于5 ml無菌LB培養(yǎng)液中搖菌(37 ℃、220 r/min、16 h)，采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8引物的合成由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成β-內酰胺酶耐藥基因引物及7個等位基因引物[7]，見表2。

1.9基因檢測與基因序列分析所有基因的檢測采用PCR法。PCR反應體系為：每反應體系引物1、2各2 μl，DNA模板1 μl，2×Taq PCR Mix 25 μl，無酶水20 μl，總體積為50 μl。PCR反應參數(shù)：94 ℃預變性90 s，94 ℃變性20 s，退火溫度20 s，72 ℃延伸1 min/kb，30個循環(huán)， 72 ℃延伸5 min。擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V、45 min)后在凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結果。陽性結果的PCR反應體系送至安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進行基因測序，并將耐藥基因測序結果在BLAST上比對。

表2 PCR引物序列

1.10MLST數(shù)據(jù)分析采用Oxford法將7個等位基因的測序序列提交至pubmlst網(wǎng)站進行在線序列比對，并獲得對應的等位基因號(allele number)及序列型(sequence type,ST),應用eBURST軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果

2.1標本基本情況分析患者年齡20～82(58.3±17.5)歲，男20例(71.4%)，女8例(28.6%)。28株CRAB均來自ICU同一病區(qū)，其中25株分離自痰標本，1株分離自血標本，2株分離自引流液標本。

2.2藥敏試驗結果28株CRAB對亞胺培南和美羅培南全耐藥，除對多黏菌素、替加環(huán)素和米諾環(huán)素有較高的敏感率，對其他14種抗生素均高度耐藥，見表1。

2.3CIM結果28株CRAB菌株CIM結果均為陽性，見圖1。圖中MH培養(yǎng)基均勻涂布0.5麥氏的大腸埃希菌ATCC25922，3張亞胺培南紙片分別經(jīng)3株樣本菌株孵育后，加入MH平板上，大腸埃希菌ATCC25922生長未受到抑制，即未出現(xiàn)抑菌圈。

圖1 部分CRAB碳青霉烯酶抑制實驗結果

2.4β-內酰胺酶耐藥基因檢測結果28株CRAB均含有blaOXA-51和blaampC，25株(89.3%)菌株攜帶blaOXA-23，14株(50%)菌株攜帶blaTEM。未檢測出blaNDM-1、blaKPC和blaSHV等其他基因。隨機抽取部分blaOXA-51、blaampC、blaOXA-23和blaTEM基因PCR產物進行測序，并將測序結果在BLAST比對，結果均對應上述4種基因，見圖2、3。

2.5MLST結果將28株CRAB進行MLST分型，得到9種ST型，其中ST1789、ST1790、ST1791和ST1792為新的ST型，見表3。采用eBURST軟件進行分析，得到一個同分型組及兩個單體(ST1790和ST1792)，見圖4。圖中ST369為各ST型共同的祖先(Founder)，與其親緣關系較近的單位點變異株(SLVs)為ST191、ST195、ST368、ST369、ST1789以及ST1791。

表3 MLST結果

*表示新發(fā)現(xiàn)的ST型

3 討論

鮑曼不動桿菌在全球的廣泛播散受到越來越多的關注，世界衛(wèi)生組織已將鮑曼不動桿菌判定為ESKAPE中最嚴重的細菌之一。2012年中國CHINET監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，國內不同地區(qū)15所醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動桿菌約1/4來自于ICU病區(qū)[8]。本研究收集了ICU病區(qū)共28株CRAB，患者平均年齡為58.3歲，標本來源以痰標本為主，說明患者年齡較大和自身免疫力差是鮑曼不動桿菌感染的重要危險因素，且鮑曼不動桿菌感染以呼吸系統(tǒng)為主，這與王濤、郭勇 等[9-10]的研究結果一致。

圖2 部分菌株PCR電泳圖片M：DNA Marker；1～15：不同菌株目的基因擴增條帶

圖3 4種基因部分測序圖片

A：OXA-23基因部分測序圖片；B：OXA-51基因部分測序圖片；C：TEM基因部分測序圖片；D：ampC基因部分測序圖片

圖4 eBURST軟件分析結果圖

本研究結果顯示，28株CRAB對哌拉西林、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星和哌拉西林/他唑巴坦均耐藥，僅有4株(14.3%)對甲氧芐啶/磺胺甲惡唑敏感，2株(7.1%)對四環(huán)素敏感，2株(7.1%)對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星和左氧氟沙星同時敏感，然而28株CRAB對多黏菌素、替加環(huán)素和米諾環(huán)素具有很高的敏感率(92.9%～100%)，提示CRAB對常用抗生素的耐藥率較高。因此，應高度重視ICU鮑曼不動桿菌引起的感染，根據(jù)藥敏結果合理使用抗生素。

鮑曼不動桿菌的耐藥機制復雜，目前國內外研究表[11]明產生水解碳青霉烯類的β-內酰胺酶是其最常見的耐藥機制，其中最常見的是D類OXA型碳青霉烯酶。本研究結果顯示28株CRAB均攜帶blaOXA-51和blaampC，25株(89.3%)攜帶blaOXA-23，14株(50%)攜帶blaTEM，這與王輝 等[12]的研究結果相近，說明本院CRAB攜帶的β-內酰胺酶耐藥基因與全國總體一致。

采用Bartual et al[13]建立的MLST方案進行同源性分析，結果得到9種ST型，其中ST1789、ST1790、ST1791和ST1792為新的ST型。經(jīng)過eBURST軟件分析得到一個同分型組及兩個單體，其中ST191、ST195、ST368、ST369、ST1779、ST1789和ST1791具有同源相關性。本研究結果顯示ST1779(28.6%)、ST195(17.9%)以及ST1789(21.4%)為主要感染株，提示本ICU鮑曼不動桿菌感染存在流行趨勢。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細胞間轉移機制有轉化、轉導以及結合等形式,而結合是常見的傳播耐藥性的機制[14]。耐藥基因可以通過轉座子或者質粒在細菌之間傳播，從而導致多重耐藥菌的流行。因此，應加強各種醫(yī)療器械及醫(yī)療用品的消毒管理，提高醫(yī)務人員的手衛(wèi)生意識，嚴格執(zhí)行無菌操作及消毒隔離，防止患者交叉感染；同時應根據(jù)藥敏結果合理使用抗生素，減少以及延緩耐藥菌的出現(xiàn)[15]?？偠灾琁CU病區(qū)CRAB檢出率較高，耐藥性較強，耐藥機制復雜，應加強消毒隔離，合理使用抗生素，持續(xù)監(jiān)測防止其暴發(fā)流行。