基于生存分析模型挖掘HSPB1基因表達(dá)與放療敏感性關(guān)系研究

江慶華，王亞民，湯在祥

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，根據(jù)2017年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]，其發(fā)病率和死亡率高居第二位。熱休克蛋白(heat shock protein beta-1，HSPB1)是近年發(fā)現(xiàn)的重要蛋白，與腫瘤的發(fā)生以及放射治療的預(yù)后有密切關(guān)系。通過雙向凝膠電泳及同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)研究[2]表明，HSBP1基因在前列腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，生物信息學(xué)分析提示HSPB1在基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中處于一個非常重要的中心位置。在乳腺癌上，低表達(dá)的HSPB1與乳腺癌轉(zhuǎn)移惡化密切關(guān)聯(lián)，低HSPB1表達(dá)可能是一個候選腫瘤侵襲性的標(biāo)志物[3]。在放射敏感性方面，Shen et al[4]研究表明，HSPB1的過表達(dá)增強(qiáng)了口腔鱗狀上皮癌的放射敏感性，與患者放療預(yù)后顯著關(guān)聯(lián)，是放療的潛在重要生物標(biāo)志物。在肺癌研究上，HSPB1基因多態(tài)性與放射損傷關(guān)系密切，meta分析表明，HSPB1基因上rs2868371的基因多態(tài)性在高加索人群上與放射損傷關(guān)系最為密切，在亞洲人群上并無顯著關(guān)聯(lián)[5]。研究[6]表明，熱休克蛋白在諸多腫瘤組織中高表達(dá)，一般情況下患者生存結(jié)局不佳。熱休克蛋白通常以受體介導(dǎo)的信號方式影響腫瘤免疫，加速癌癥的惡性發(fā)展，熱休克蛋白與腫瘤干細(xì)胞的世代更新、侵染以及轉(zhuǎn)移均存在關(guān)系，并且在癌癥治療過程中也起到了負(fù)面作用。正常細(xì)胞不會分泌熱休克蛋白，如果熱休克蛋白表達(dá)水平高，這反映出細(xì)胞或機(jī)體的生理環(huán)境壓力比較大，腫瘤的惡化傾向性比較高，在此條件下放射治療可能意義不大。反過來，如果熱休克蛋白表達(dá)水平低，說明細(xì)胞或機(jī)體的生理環(huán)境壓力比較小，則此條件下放射治療的療效可能會顯現(xiàn)出來。然而，有關(guān)胃癌放療敏感性與HSPB1表達(dá)的二者之間關(guān)系，到目前為止國內(nèi)外還沒有相關(guān)研究報道，該研究旨在探討HSPB1的表達(dá)水平與胃癌放療敏感性的關(guān)系，分析其是否有可能成為放療敏感性的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源本研究數(shù)據(jù)選自TCGA數(shù)據(jù)庫，下載數(shù)據(jù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)清理，步驟為：第一步，對臨床信息數(shù)據(jù)，隨訪信息數(shù)據(jù)，按患者編號進(jìn)行合并，然后，去除無生存時間或生存結(jié)局的患者，也去除放射治療信息缺失的患者，獲得完整的生存信息和其他臨床信息。將此部分臨床信息，按患者編號與獲得的HSPB1的mRNAseq數(shù)據(jù)合并，即獲得用于最后數(shù)據(jù)分析的數(shù)據(jù)，此數(shù)據(jù)包括完整的生存信息，放射治療信息，HSPB1的mRNAseq表達(dá)數(shù)據(jù)，以及其他的臨床信息，該數(shù)據(jù)包括371例患者。該分析數(shù)據(jù)集與本研究團(tuán)隊前期發(fā)表的研究[7-8]報道一致。

1.2分析方法本研究定義放療敏感性為在經(jīng)過放療后，與未經(jīng)過放療的患者對比，患者的生存率提高，則定義為患者具有放療敏感性，與此相關(guān)的具有敏感性預(yù)測能力的基因，稱為放療敏感性預(yù)測的生物標(biāo)志物[7-8]。由于未獲得外部獨立數(shù)據(jù)，為了驗證本研究的結(jié)論，在分析過程中，將數(shù)據(jù)隨機(jī)分為兩組，一組作為測試組數(shù)據(jù)，一組作為驗證組數(shù)據(jù)。對兩組使用相同的分析方法，如果結(jié)論均和本研究假設(shè)一致，則驗證本研究假設(shè)，說明HSPB1的表達(dá)與放療敏感性相關(guān)；因HSPB1的表達(dá)值呈偏態(tài)分布，故將中位數(shù)設(shè)作高低表達(dá)的臨界值，分別對高低表達(dá)的患者進(jìn)行統(tǒng)計分析，比較研究兩者之間的生存差異[7-8]。

本研究選擇的統(tǒng)計軟件為R軟件，利用其survival包的生存分析模型開展研究工作，選擇的生存分析模型為：H(t|X)=h0(t)exp(Xβ)，其中X包括臨床指標(biāo)，以及HSPB1表達(dá)水平等信息，以P<0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用rms包進(jìn)行生存曲線作圖。兩組生存率比較采用Log Rank檢驗獲得P值，多因素調(diào)整中，采用Wald檢驗計算P值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理選擇R軟件，組間對比采用χ2或Fisher確切概率法，組間總生存的比較采用Log Rank檢驗，不同臨床因素與總生存關(guān)系采用單因素和多因素方法進(jìn)行生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HSBP1表達(dá)水平與臨床指標(biāo)和生存期的相關(guān)性研究本研究把總生存作為主要觀察結(jié)局，首先分析HSPB1表達(dá)水平及其他臨床指標(biāo)與生存時間關(guān)聯(lián)性分析。對測試組數(shù)據(jù)和驗證組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果見表1。由分析結(jié)果可見，放療與患者生存獲益緊密關(guān)聯(lián)，在兩份數(shù)據(jù)中，單因素分析和多因素分析均有統(tǒng)計學(xué)意義。其他因素，如年齡、N分期，則可能有統(tǒng)計學(xué)意義。而HSPB1表達(dá)水平無論單因素或多因素分析結(jié)果均提示與總生存沒有顯著關(guān)聯(lián)。在測試組數(shù)據(jù)和驗證數(shù)據(jù)中，多因素分析P值分別為0.61和0.30。上述分析結(jié)果顯示，HSPB1表達(dá)水平與總生存無明顯關(guān)聯(lián)，盡管放療與總生存率存在關(guān)聯(lián)，但如能篩選出哪些患者具有更好的放療效應(yīng)，則可實現(xiàn)更為精準(zhǔn)的放療。

表1 臨床指標(biāo)及HSPB1表達(dá)水平與總生存的關(guān)系

SRT：印戒細(xì)胞癌；DT：彌漫型胃癌；MT：黏液腺癌；PT：乳頭狀腺癌；TT：管狀腺癌；HR：風(fēng)險比

2.2HSPB1表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系為分析HSPB1與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，本研究采用χ2分析方法分析了HSPB1的表達(dá)與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，HSPB1的表達(dá)無論在測試組數(shù)據(jù)中還是在驗證組數(shù)據(jù)中均和各臨床指標(biāo)無明顯關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，如果HSPB1表達(dá)水平能夠提示放療敏感性，則可能是個獨立于腫瘤臨床指標(biāo)的有效分子標(biāo)志物。見表2。

表2 HSPB1表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系(n)

2.3高低表達(dá)組放療與生存的關(guān)系HSPB1低表達(dá)患者的放療敏感性存在與否是本研究的目的，即HSPB1低表達(dá)患者在放療后，生存率是否提高。分別對測試組數(shù)據(jù)和驗證組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立統(tǒng)計分析處理。表3結(jié)果表明，無論放療與否，高表達(dá)組總生存率并沒有明顯差異，其他臨床因素調(diào)整后依然沒有明顯差異。在低表達(dá)組中，研究顯示：經(jīng)過放療的HR為0.30(0.10～0.85)，其他臨床因素調(diào)整后HR為0.22(0.06～0.81)，P值分別為0.02和0.02，在驗證組數(shù)據(jù)中，結(jié)果與測試組數(shù)據(jù)的結(jié)果一致，即在低表達(dá)組中，接受放療的患者生存率顯著提高，多因素調(diào)整后的HR為0.03(0.003～0.22)，P值為1.07×10-3。該研究揭示在低表達(dá)組這一群體中，經(jīng)過放療的患者和未經(jīng)過放療的患者，兩者之間的生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)過放療的患者生存率較高。

圖1依次展示了測試組數(shù)據(jù)和驗證組數(shù)據(jù)中HSPB1高低表達(dá)組放療和非放療組的生存率曲線。在低表達(dá)組(圖1B、1D)，接受放療的患者生存率與未接受放療的患者生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而在高表達(dá)組(圖1A、1C)，兩組生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果與本研究假設(shè)一致。通常情況下，樣本量過小易產(chǎn)生假陽性，為擴(kuò)大樣本容量進(jìn)行分析，接下來把兩組數(shù)據(jù)合并處理，研究顯示，與未經(jīng)過放療群體的數(shù)據(jù)比較，在高表達(dá)組群體中，放療調(diào)整后HR為1.03(0.53～1.99)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.94),而在低表達(dá)組中，放療調(diào)整后HR為0.10(0.03～0.28)，P值為1.23×10-5。調(diào)整因素包括：年齡、性別、TNM分期、靶向治療等。上述分析結(jié)果表明，HSPB1低表達(dá)患者可能具有的放療敏感性，在接受放療后，其生存率可能會獲得改善。合并后的高表達(dá)和低表達(dá)組放療和非放療情況下的生存曲線見圖2A、2B，所有放療患者中HSPB1高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存曲線見圖2C。在低表達(dá)組中，接受放療的患者生存率與未接受放療的患者生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在所有接受放療的患者中，HSPB1低表達(dá)患者與高表達(dá)患者生存率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果提示，HSPB1低表達(dá)患者可能具有的放療敏感性。

3 討論

在過去的研究中，盡管胃癌放療并不是主要的治療手段，但一般認(rèn)為胃腺癌對放療比較敏感，一般情況下，經(jīng)過放療后，患者生存率將有所提高。本研究依據(jù)TCGA數(shù)據(jù)的研究結(jié)果也驗證了這一點，即放療與總生存率兩者之間存在明顯相關(guān)性。但這不等同于經(jīng)過放療后全部患者生存率均會有所提高，作為腫瘤治療的重要手段，放療產(chǎn)生的毒副作用和遠(yuǎn)期影響也是不容忽視的，因此精準(zhǔn)放療顯得尤為重要。從精準(zhǔn)放療的角度看，倘若將全部胃腺癌患者中不具有放療敏感性的區(qū)分出去，留下具有顯著放療敏感性患者接受放療，這將使得放療更加有效和有針對性，同時也使得不敏感的患者避免了放療帶來的不良反應(yīng)。因此，找到合適的生物標(biāo)志物分辨敏感人群，實施精準(zhǔn)放療，對于臨床治療具有重要意義[7-8]。然而，截止目前，在胃癌上尚未發(fā)現(xiàn)有效的分子標(biāo)志物。

圖1 測試組數(shù)據(jù)和驗證組數(shù)據(jù)HSPB1表達(dá)水平與放療后生存關(guān)系A(chǔ)、B:測試組數(shù)據(jù)高、低表達(dá)患者；C、D:驗證組數(shù)據(jù)高、低表達(dá)患者

圖2 全部患者HSPB1表達(dá)水平與放療后患者生存關(guān)系A(chǔ)：高表達(dá)患者；B：低表達(dá)患者；C：接受放療的患者

表3 HSPB1高、低表達(dá)組放療與總生存率關(guān)系分析

本研究數(shù)據(jù)來自TCGA公開數(shù)據(jù)庫的挖掘，對獲得的數(shù)據(jù)開展清理、歸類、統(tǒng)計分析等研究工作。考慮到缺乏獨立外部數(shù)據(jù)驗證這一實際情況，研究工作采取交叉驗證的方法，即將數(shù)據(jù)隨機(jī)分成兩份，各自進(jìn)行統(tǒng)計分析[7-8]，結(jié)果顯示，HSPB1高表達(dá)患者群體對放療不敏感，而低表達(dá)患者群體對放療敏感，經(jīng)過放療后，生存期更久，該研究結(jié)果對于臨床放療具有一定的指導(dǎo)意義。

臨床實踐中發(fā)現(xiàn)患者放療后腫瘤退縮程度出現(xiàn)顯著差異，這主要是由個體間異質(zhì)性造成的。基礎(chǔ)研究[9-10]表明，放療的主要靶點是DNA，而放射敏感性主要取決于DNA損傷的修復(fù)能力，與DNA修復(fù)功能相關(guān)的基因突變、多態(tài)性等均可使放射敏感性出現(xiàn)差異。HSPB1是熱休克蛋白家族中27×103ku的小分子熱休克蛋白，在DNA修復(fù)方面起著重要的作用，是重要的腫瘤治療預(yù)后指標(biāo)[10-12]。研究[10，13]表明，如果鼻咽癌細(xì)胞中HSPB1表達(dá)上升，將提高鼻咽癌細(xì)胞對放射線抵抗力。此外，在肺癌中，HSPB1的基因多態(tài)性與放療敏感性關(guān)系已有深入研究[14-15]。上述這些研究表明HSPB1基因在放射修復(fù)、放療敏感性方面可能處于重要環(huán)節(jié)。

關(guān)于HSPB1與胃癌放射敏感性研究在國內(nèi)外尚未見報道，本研究存在樣本量較小，且僅僅為TCGA數(shù)據(jù)等缺陷，盡管本研究采用交叉驗證策略，挖掘了HSPB1與胃癌放射敏感性的關(guān)系，為胃癌放射敏感性的基礎(chǔ)和臨床研究提供了線索，但確切的結(jié)論仍需要進(jìn)一步的實驗室數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的證實。