橋本甲狀腺炎對子宮雌激素受體α表達(dá)影響

樊 華，李 莉，夏 琴，柳田田，朱德發(fā)

橋本甲狀腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)又稱慢性淋巴性甲狀腺炎，是一種好發(fā)于女性、以甲狀腺大量淋巴細(xì)胞浸潤及血清甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody,TgAb),甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)陽性為特征的自身免疫性疾病[1-2]。近年來關(guān)于女性HT患者出現(xiàn)不孕現(xiàn)象的臨床報(bào)道不斷增多。妊娠是一個復(fù)雜的過程，而良好的子宮內(nèi)膜狀態(tài)為妊娠的前提。子宮內(nèi)膜狀態(tài)受到雌激素及其受體的參與調(diào)節(jié)，雌激素通過與子宮雌激素受體的結(jié)合改變子宮內(nèi)膜形態(tài)[3-4]。雌激素受體為核受體超家族中一員，分為ERα、ERβ兩種亞型，其中子宮以ERα為主，在女性生殖系統(tǒng)起主要作用[5]。雌激素受體表達(dá)異常會影響內(nèi)膜發(fā)育[6]。所以建立實(shí)驗(yàn)動物模型，檢測動情周期，了解最佳受孕期動情期[7]HT組小鼠子宮內(nèi)膜ERα水平，同時檢測子宮局部細(xì)胞因子水平觀察HT全身免疫紊亂在子宮局部的表現(xiàn)，為亟待解決的臨床橋本氏病致不孕問題提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物取30只8～9周齡NOD雌性小鼠，購自北京華阜康生物科技有限公司。安徽醫(yī)科大學(xué)毒理實(shí)驗(yàn)室動物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)，體質(zhì)量20～23 g。

1.2主要儀器及試劑豬甲狀腺球蛋白(pig thyroglobulin,pTG)、弗氏完全佐劑(complete freund's adjuvant,CFA)、弗氏不完全佐劑(incomplete freund's adjuvant,IFA)(美國Sigma公司)；三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、TgAb及TPOAb試劑盒(德國Roche公司)；促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)ELISA試劑盒(USCNLIFE公司,CEA463Mu)；兔抗鼠ERα單克隆抗體(美國Abcam公司)；免疫組化化學(xué)染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；細(xì)胞因子試劑盒(美國BD公司); 普通PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器公司)；低速迷你離心機(jī)(海門其林貝爾儀器制備有限公司)；高速臺式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；萬分之一電子天平(上海菁海儀器有限公司)；熒光定量PCR儀、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；微板孔迷你離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)；氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC-H2O、快速瑞氏染液(南京建成科技有限公司)；蘇木精染液(北京索萊寶科技有限公司);熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPlus 6.0，美國Media Cybernetics公司)。

1.3動物造模方法30只NOD雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成兩組，即CON組和HT組，各15只。造模步驟：將25 μg pTg溶于100 μl PBS溶液中，CFA與pTg溶液1 ∶1混合于研缽中，冰浴條件下研磨至完全乳化。隨后將乳狀劑抽到一次性注射器中，固定小鼠，在HT組小鼠尾根部1 cm處皮下注射，每只0.1 ml。在CON組注射等量不含pTg的CFA乳化劑。14 d后將CFA替換成IFA，與pTg制備成乳化液，同樣操作方法在HT組小鼠尾根部1 cm處皮下注射，每只0.1 ml。在CON組注射等量不含pTg的IFA乳化劑。造模周期49 d。實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.4血清甲狀腺素水平測定小鼠經(jīng)乙醚麻醉后開腹腔，下腔靜脈取血1 ml,3 000 r/min離心10 min分離血清，于4 ℃冰箱保存血清。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清T3、T4、TgAb、TPOAb水平，ELISA法測定血清TSH水平。

1.5陰道脫落細(xì)胞染色篩選動情期小鼠陰道分泌物涂片制作步驟：在載玻片上滴一滴生理鹽水；取雌性小鼠，于每日上午7～8點(diǎn)檢查(連續(xù)觀察1周),篩選出處于動情期的小鼠。將小鼠背部皮膚握住，尾部朝上，用棉簽插入陰道內(nèi)稍旋轉(zhuǎn)一下，然后抽出；用棉簽在載玻片的生理鹽水里涂一下，使棉簽上的細(xì)胞進(jìn)入生理鹽水。瑞氏染色步驟：將玻片平置與染色架上，滴加試劑A 3～5滴，使其迅速蓋滿玻片，染色約1 min以固定玻片；滴加試劑B 6～10滴，用洗耳球?qū)?zhǔn)玻片吹氣充分混合染液，染色5～8 min；蒸餾水沖洗30 s，自然風(fēng)干，中性樹脂封片；鏡檢。

1.6免疫組化染色檢測子宮內(nèi)膜ERα表達(dá)將兩組小鼠頸椎脫臼法處死，暴露腹腔，取“Y”字子宮組織，于分叉處剪斷，一側(cè)用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片。另一側(cè)子宮浸泡于4%多聚甲醛固定。選出陰道脫落細(xì)胞染色法確定為動情期的小鼠子宮5 μm石蠟切片,脫蠟，逐級水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min，微波抗原修復(fù)，PBS沖洗后血清封閉45 min，一抗37 ℃孵育1 h，4 ℃濕盒過夜(1 ∶1 000)，37 ℃水浴箱復(fù)溫1 h,PBS沖洗后滴加二抗37 ℃水浴30 min，PBS沖洗后滴加SP 37 ℃水浴30 min。PBS沖洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染25 s，PBS返藍(lán)10 min，逐級脫水后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，CON組和HT組均于400倍下隨機(jī)選取3個視野，形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析圖片，計(jì)算視野內(nèi)陽性細(xì)胞百分比，取平均值。

1.7RT-PCR法檢測ERα、白介素(interleukin,IL)-6、IL10mRNA水平提取總RNA:取100 mg組織加入1 ml TRIzol,冰上放置5 min，槍頭吹打；每孔裂解液加到EP管中，加0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液約500 ml加入另一EP管中；加入0.5 ml異丙醇，溫和混勻，室溫放置10 min；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄去上清液；加入1 ml 75%乙醇(DEPC水配置)，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄去上清液；室溫放置30 min干燥RNA沉淀；加入20～50 μl DEPC水，55 ℃促溶10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增β-actin：上游引物：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游引物：5′-TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA-3′；PCR擴(kuò)增片段長度為150 bp。擴(kuò)增ERα上游引物：5′-AGATGACTTGGAAGGCCGAA-3′,下游引物：5′-TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA-3′,PCR擴(kuò)增片段長度為117 bp。擴(kuò)增IL-6上游引物：5′-AGTCCGGAGAGGAGACTTCA-3′，下游引物：5′-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3′；PCR擴(kuò)增片段長度為108 bp 。擴(kuò)增IL-10上游引物：5′-TGCACTACCAAAGCCACAAG-3′，下游引物：5′-TCAGTAAGAGCAGGCAGCAT-3′； PCR擴(kuò)增片段長度為88 bp。RT反應(yīng)：在0.2 ml EP管中，加入總RNA(質(zhì)量為1 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μl、DEPC水補(bǔ)足至12 μl，輕輕混勻、點(diǎn)動離心；PCR儀上65 ℃加熱5 min，立即冰浴3 min；在上述EP中加入5×Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、RibolockTMRnase inhibitor 1 μl、RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcniptase 1 μl；42 ℃、60 min，70 ℃、5 min；取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩晒舛縋CR反應(yīng)：取出cDNA作為熒光定量的模板，反應(yīng)體系如下：2×SYBR Greenmixture 5 μl；上游引物(10 μmol/L)1μl；下游引物(10 μmol/L)1 μl；cDNA 1 μl；不含RNase的純水 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃變性 2 min;95 ℃ 退火5 s;60 ℃延伸10 s,3個步驟進(jìn)行40個循環(huán)。熒光定量結(jié)果用 2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

1.8CBA法檢測IL-6、IL-10濃度冰上勻漿子宮組織，制備成樣本；制備細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品；混合細(xì)胞因子捕獲微球；捕獲微球，樣本50 μl，檢測抗體混合后室溫下共孵育2 h；儀器調(diào)校微球調(diào)節(jié)設(shè)置流式細(xì)胞儀條件；清洗捕獲微球/樣本/檢測抗體復(fù)合物；上機(jī)檢測；運(yùn)用FCAPv1.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1組小鼠血清激素及抗體水平與CON組比較，HT組TgAb、TPOAb顯著升高(P<0.05)，兩組T3、T4、TSH差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組血清甲狀腺激素及TgAb、TPOAb水平

與CON組比較：*P<0.05

2.2陰道脫落細(xì)胞染色結(jié)果CON組和HT組各期在陰道涂片檢查的特點(diǎn)：動情前期：全部為有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化上皮細(xì)胞；動情期：大量大而角化的無核細(xì)胞，或間有少量有核上皮細(xì)胞；動情后期：白細(xì)胞，角化上皮細(xì)胞，有核上皮細(xì)胞均有；動情間期：大量白細(xì)胞，少量上皮細(xì)胞和黏液。HT組結(jié)果見圖1。

圖1HT組小鼠動情周期陰道上皮細(xì)胞變化瑞氏染色×200

A：動情前期；B：動情期；C：動情后期；D：動情間期

2.3兩組小鼠免疫組化結(jié)果CON組和HT組動情期子宮內(nèi)膜均有ERα免疫陽性細(xì)胞表達(dá)。子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮及基質(zhì)均有表達(dá)。陽性物質(zhì)主要存在于胞核，胞質(zhì)亦有表達(dá)。見圖2。以平均光密度(average optical density,AOD)值進(jìn)行量化分析兩組子宮內(nèi)膜陽性反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果顯示CON組子宮內(nèi)膜ERα水平AOD值(0.220±0.139,n=7)，與HT組 AOD值(0.135±0.082,n=9)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.165，P<0.05)。

圖2 動情期ERα在子宮內(nèi)膜分布情況 ×400A： CON組 ; B ：HT組

2.4PCR結(jié)果HT組小鼠動情期子宮內(nèi)膜ERα mRNA水平(1.000±0.208,n=9)低于CON組(0.571±0.082,n=7)(t=5.693，P<0.05)，IL-6和IL-10 mRNA水平均為HT組低于CON組表達(dá)(P<0.05)，見表2。

2.5CBA檢測兩組小鼠子宮細(xì)胞上清液IL-6及IL-10濃度結(jié)果HT組IL-6水平明顯低于CON組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HT組IL-10水平明顯低于CON組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 兩組子宮IL-6和IL-10 mRNA及蛋白水平

與CON組比較：*P<0.05

3 討論

HT特征為血清中TgAb、TPOAb升高。本課題利用pTg結(jié)合CFA和IFA，經(jīng)NOD雌性小鼠尾根部皮下注射制成HT實(shí)驗(yàn)動物模型[8]，結(jié)果示HT組小鼠血清自身抗體TgAb、TPOAb顯著升高，提示造模成功。

正常大鼠動情周期包括：動情前期、動情期、動情后期和動情間期。臨床多選用陰道脫落細(xì)胞染色來鑒別動情周期[7]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測動情周期來觀測最佳受孕期動情期，實(shí)驗(yàn)顯示CON組陰道脫落細(xì)胞瑞氏染色結(jié)果與以往其他鑒別動情周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[7]，HT組動情周期各期陰道脫落細(xì)胞染色結(jié)果與CON組小鼠各期結(jié)果相似，表明HT小鼠存在動情周期，提示HT小鼠可以受孕。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化法和RT-PCR方法檢測懷孕相關(guān)受體ERα在動情期子宮內(nèi)膜上的分布情況和表達(dá)水平，了解HT小鼠受孕能力。結(jié)果顯示HT組小鼠動情期子宮內(nèi)膜ERα mRNA及蛋白水平均低于CON組。馮雪 等[9]發(fā)現(xiàn)在建立的內(nèi)異癥裸鼠的在位子宮內(nèi)膜上，ERα表達(dá)降低。另有研究[10]對黃體功能不足者子宮內(nèi)膜雌激素受體測定顯示含量較正常低。以上疾病均可導(dǎo)致女性受孕率低下甚至不孕。但目前關(guān)于HT組小鼠動情期子宮內(nèi)膜ERα含量低下的原因不清楚。HT是免疫系統(tǒng)疾病，可致全身免疫系統(tǒng)紊亂，選擇性檢測子宮組織局部IL-6及IL-10兩個細(xì)胞因子水平，觀察子宮局部免疫功能是否紊亂。

RT-PCR檢測HT組的子宮IL-6和IL-10 mRNA水平均顯著低于CON組，CBA法測出HT組IL-6和IL-10蛋白含量低于CON組。IL-6是一種能參與自身免疫和炎癥的多功能細(xì)胞因子[11]，在子宮是由內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞所分泌[12-13]，主要影響子宮內(nèi)膜接受囊胚植入的能力。IL-10作為一種多效應(yīng)的抗炎性細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞所分泌，能抑制前炎性細(xì)胞因子的分泌[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)子宮低水平的IL-6和IL-10，推測可能是HT導(dǎo)致的子宮局部的免疫紊亂，而這種免疫紊亂可能會影響女性HT患者受孕。