HK2在肝癌中的差異表達及其對肝癌細胞的影響

張 宇，蒙 軒，王 勛

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種臨床上高死亡率的原發性肝癌[1-2]。癌細胞的失控生長是癌癥高致死率的主要原因，探討肝癌發生發展分子機制，尋找肝細胞癌惡性增殖的生物標志和干預治療靶點，已成為近年來肝癌研究的熱點[3]。研究[4]表明己糖激酶(hexokinase, HK)是生物糖酵解途徑限速酶，己糖激酶2(HK2)與諸多惡性腫瘤發生存在關系。目前HK2與肝癌發生發展的關系少見報道，通過高通量測序發現其可能高表達，但缺乏深入的研究[5]。該研究旨在探討HK2在肝癌中的表達特點并分析其表達與臨床特征參數的關系，檢測其對人肝癌高轉移細胞株HepG2細胞增殖、周期、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1組織樣本及主要試劑

1.1.1病例資料及實驗細胞 選取2015年6月～2018年10月中國人民解放軍總醫院肝膽外科、中國人民解放軍第302醫院肝膽外科肝細胞肝癌手術患者，共計48例，取肝癌組織(非壞死區腫瘤組織)及癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm肝硬化組織，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)。所有新鮮組織獲取后立即轉入液氮固定。人肝癌高轉移細胞株HepG2細胞購自北京協和基礎研究所細胞中心 。

1.1.2主要試劑 蛋白提取RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑、細胞周期檢測碘化丙啶染色試劑購自江蘇碧云天公司；細胞轉染試劑Lipo 3000購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；HK2抗體、GAPDH抗體購自英國abcam公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測肝癌組織HK2表達量 所有組織標本(48例肝癌組織，48例癌旁組織)常規甲醛固定及石蠟包埋，將蠟塊切成5 um厚的組織切片，覆蓋于預先經過防脫處理的載玻片上，經過烤片、水化、抗原修復，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，中性樹膠封片。光學顯微鏡拍照，采用IPP軟件對圖片進行積分光密度(integrated option density，IOD)值。

1.2.2HK2 shRNA載體構建 設計并合成4對小發卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)序列，分別命名為shRNA_1、shRNA_2、shRNA_3、shRNA_4，其序列見表1?？寺∵B接實驗室改造的pLKO.1-GFP質粒。測序驗證后，轉染至HepG2細胞。

表1 4對候選HK2 shRNA序列

1.2.3Western blot檢測HK2表達 收集人正常肝細胞L-02、人肝癌細胞HepG2；以及control RNA、shRNA_1、shRNA_2、shRNA_3、shRNA_4組HepG2細胞，RIPA細胞蛋白裂解液提取蛋白，BCA法用于蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后NC膜恒流濕法進行轉膜。轉膜成功的NC膜轉移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉l h。再將NC膜分別加入稀釋的HK2和GADPH一抗，4 ℃輕搖過夜；隨后加入相應的二抗(1 ∶100稀釋)，37 ℃恒溫搖床孵育1 h。蛋白的相對表達量用待測蛋白與GADPH的灰度值比值計算。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖 將空白組(正常培養、未轉染質粒)、control shRNA組(轉染control shRNA)、HK2 shRNA組(轉染shRNA_3)HepG2細胞穩定培養后傳代于96孔板，完全培養基培養，分別于第0、24、36、72小時進行MTT檢測。每組4個復孔。96孔板每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml PBS溶解)，孵育4 h然后棄除上清液。每孔里面再加入150 μl Formazan溶解液，振蕩10 min，充分溶解結晶物。酶標儀(570 nm)測定吸光度(optical density, OD)值。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期 各組細胞完全培養基培養，用胰酶消化收集細胞，加入1 ml 75%預冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上，再加入PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，清洗2次。重懸細胞用0.5 ml PBS，每孔加入PI和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37 ℃溫浴30 min。流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡 收集各組細胞，置于100目銅網上輕搓，生理鹽水沖洗，2 500 r/min離心棄去上清液及細胞碎片，收集細胞懸液。參照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明，通過流式細胞儀進行分析。

2 結果

2.1HK2在肝癌中差異表達免疫組化結果顯示：相對于癌旁組織，HK2在肝癌組織中表達顯著升高；IOD值量化結果表明肝癌組織中HK2相對表達值為(643.00±79.17)，癌旁組織中HK2相對表達值為(441.80±31.32)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1A。Western blot結果顯示：相對于人正常肝細胞L-02，HK2在人肝癌細胞HepG2中表達顯著升高；灰度值量化結果表明L-02細胞HK2相對表達值為(1.08±0.14)，HepG2中HK2相對表達值為(1.46±0.18)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1B。

2.2HK2表達與肝癌臨床病理特征關系48例肝組織中HK2表達與患者性別、年齡、血清甲胎蛋白(alpha-feto protein, AFP)含量、乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)感染差異無統計學意義(P>0.05)，與腫瘤直徑、TNM分期、組織病理分級差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3HepG2細胞中HK2沉默表達與效率評價Western blot檢測HK2 shRNA_1、shRNA_2、shRNA_3、shRNA_4轉染HepG2細胞后HK2蛋白表達情況：HK2 shRNA_3沉默效率最佳，其HK2蛋白表達均顯著低于control shRNA組。建立穩定轉染的細胞株HK2 shRNA、control shRNA，熒光顯微鏡檢測轉染效率，用于后面實驗檢測。見圖2。

2.4沉默HK2表達對肝癌HepG2細胞增殖的影響MTT法檢測各組細胞增殖活性：48 h起，HK2 shRNA組細胞增殖活性明顯低于control shRNA組和空白組，72 h時差異有統計學意義(F=55.6，P<0.01)，空白組HepG2細胞和control shRNA組細胞增殖活性差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。表明HK2表達的降低可顯著降低HepG2細胞增殖活性。

圖1 HK2在肝癌中差異表達

2.5沉默HK2表達對肝癌HepG2細胞周期的影響流式細胞儀檢測各組細胞周期：HK2 shRNA組、control shRNA組、空白組S期細胞百分比分別為(24.48%±4.25%)、(32.32%±3.98%)、(38.68%±5.17%)，經單因素方差分析，組間差異有統計學意義(F=7.51，P<0.05)。表明HK2 shRNA組細胞更少停滯在S期，細胞周期發生明顯轉變，見圖4。

表2 HK2表達與肝癌臨床病理特征關系(n)

圖2 HepG2細胞中HK2沉默表達與效率評價

2.6沉默HK2表達對肝癌HepG2細胞凋亡的影響Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測各組細胞凋亡：HK2 shRNA組、control shRNA組、空白組的細胞總凋亡率分別為分別為(17.74±2.67)%、(8.97±1.02)%、(6.83±0.95)%，經單因素方差分析，組間差異具有統計學意義(F=33.16，P<0.01)。HK2表達的降低可顯著升高HepG2細胞凋亡率，且與control shRNA組相比差異有統計學意義(P<0.01)，空白組HepG2細胞和control shRNA組細凋亡率差異無統計學意義(P>0.05),見圖5。提示HK2可能通過抑制凋亡促進腫瘤生長。

圖3 沉默HK2表達對肝癌HepG2細胞增殖的影響

與空白組比較：*P<0.05；與control shRNA組比較：#P<0.05

3 討論

HK2作為機體糖酵解途徑的第一個關鍵限速酶，其與線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道蛋白相結合促進糖酵解的發生和腫瘤細胞的形成[6]，HK2在腫瘤發生進展中的作用及如何抑制HK2成為了當前研究的熱點。研究[7]表明HK2的表達與喉鱗癌腫瘤部位、臨床分期有關，在聲門上型喉鱗癌標本中HK2多呈高表達，而在聲門型喉鱗癌中多呈中到低度表達，HK2表達隨腫瘤分期的升高而增加。此外，多項研究[8-9]表明應用HK2抑制劑如3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvic acid, 3BrPA)、2-脫氧-D-葡萄糖，在腫瘤細胞和動物模型中有效干預了腫瘤的進程。研究[10]表明3-BrPA可以削弱HepG2細胞有氧糖酵解相關基因及關鍵酶的表達，抑制葡萄糖下游步驟和谷氨酰胺代謝，發揮抗腫瘤作用。

隨著分子生物學技術的迅猛發展，一些新手段用于靶向干預HK2，如shRNA技術。shRNA由于其髙度的序列專一性，可以實現特異性沉默特定基因的表達，已被廣泛用于探索基因功能及惡性腫瘤基因治療領域[11-12]。有學者[13]針對己糖激酶基因(HK1、HK2、HK3)在結直腸癌(HT-29、SW 480、HCT-15、RKO、HCT 116)和黑色素瘤(MDA-MB-435S和SK-MEL-28)細胞系中使用shRNA病毒載體沉默，分別轉染或共轉染后結果顯示HK2沉默失活與結直腸癌細胞系中HK1的表達增加有關，HK1和HK2同時表達衰減導致細胞活力下降，共轉染HK1、HK2和HK3 shRNA可導致細胞迅速凋亡，提示HK1和HK2同時失活足以減少黑色素瘤和結直腸癌細胞的增殖和存活，其可作為癌癥潛在治療靶點。張丹 等[14]觀察shRNA沉默HK2對乳腺癌細胞MDA-MB231放療敏感性的影響，結果表明給予不同劑量的X線照射后，細胞存活率呈劑量依賴性遞減的趨勢，且shRNA處理組的存活率較對照組明顯下降，細胞凋亡率明顯高于對照組，表明沉默乳腺癌細胞HK2基因可增加其對放療的敏感性。

圖4 沉默HK2表達對肝癌HepG2細胞周期的影響

圖5 沉默HK2X表達對肝癌HepG2細胞凋亡的影響

由于當前尚無有關HK2與肝細胞肝癌發生發展關系的研究報道，本研究通過沉默HK2研究其在人肝癌高轉移細胞株HepG2中功能。首先，通過檢測肝癌組織和細胞中HK2蛋白表達，結果顯示HK2在肝癌組織中表達顯著升高，與Zhang et al[5]通過高通量測序手段發現HK2可能在肝細胞腫瘤中高表達結論一致。臨床病理特征統計分析顯示HK2表達與腫瘤直徑、TNM分期、組織病理分級存在相關性，與HK2在其它腫瘤中表達意義一致。隨后，建立穩定轉染的細胞株HK2 shRNA，檢測細胞周期變化可以看出HK2沉默干擾使得細胞周期發生明顯轉變，更少停滯在S期。此外，沉默HK2表達可顯著降低HepG2細胞增殖活性，顯著升高HepG2細胞凋亡率，與HK2在結直腸癌[13]、喉鱗狀細胞癌[15]等腫瘤中作用機制一致。細胞凋亡是細胞生長分化調節的重要手段，又是機體免受腫瘤危害的重要保護機制，癌變了的細胞發生凋亡的能力通常極低，而增殖能力則相應增強，這直接導致了瘤細胞快速而病態的分裂增殖，暗示HK2可能通過抑制凋亡促進腫瘤生長。

以上實驗結果提示HK2具有抗腫瘤潛能，為肝細胞癌患者的腫瘤靶向治療提供理論基礎，并為后續的肝細胞癌侵襲轉移機制研究提供了實驗依據。但是本研究還沒有從動物水平探討沉默HK2對裸鼠移植瘤可能的影響及治療作用，有待在后續實驗中完善，有關HK2在肝癌中作用的詳細機制有待更加深入的探討。