Smad4對HEC凋亡的影響及機制研究

李 飛，周志強，吳成穩，康海涵，梁曉丹，蔡亞征, 張 毅

血管瘤(hemangioma，HEM)是一種良性腫瘤，不僅影響患者的容貌，還能夠影響相關組織器官正常功能的發揮，HEM有較為明顯的消退期、平臺期和增生期，頭頸部的發病率最高，血管瘤內皮細胞(hemangioma endothelial cells,HEC)是HEM發生主要原因，誘導HEC凋亡是治療HEM的重要途徑[1-2]。胰腺癌缺失基因(deleted in pancreatic cancer locus 4,DPC4/Smad4)有誘導細胞凋亡，抑制細胞生長的作用，在白血病細胞、前列腺癌細胞、臍靜脈內皮細胞等多種細胞中已經證實[3-5]。Smad4在增生期HEM組織中的表達水平低于退化期HEM組織，Smad4可能參與HEC凋亡[6]。該實驗通過體外分離培養增生期的HEC，通過細胞轉染的方法上調HEC中Smad4的表達，探討Smad4在增生期HEC凋亡中的作用，為明確HEM發生機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)法活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量測定試劑盒購自上海翊圣生物公司；pcDNA3.1-Smad4由鄭州大學第二附屬醫院中心實驗室構建；Lipofectamine 2000購自美國invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；ECL顯色試劑購自北京Solarbio公司；細胞周期測定試劑盒、細胞凋亡測定試劑盒購自上海碧云天公司；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)抗體購自美國CTS公司；細胞周期依賴性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)抗體購自美國Santa Cruz公司；細胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體購自天津saierbio公司；Smad4抗體購自美國ABACM公司。

1.2HEC分離培養及分組新鮮增生期HEM組織標本來自鄭州大學第二附屬醫院，組織采集經患者及家屬同意。增生期HEC分離培養步驟同文獻[7]，取增生期HEM組織，用PBS反復洗滌至溶液清亮，把周圍的皮膚和脂肪組織去除，剪成大小約為1～2 cm3的組織碎塊，置于0.25%的胰蛋白酶中，在37 ℃的水浴中消化20 min。用含胎牛血清的M199終止消化，把消化后的組織塊剪碎成≤1 mm×1 mm×1 mm的小碎塊，種植到培養瓶內，把培養瓶倒置培養10 min后，加入培養液，使培養液完全覆蓋組織塊，3 d后換液，6 d后把組織塊清除掉，9 d傳代培養(0.25%胰蛋白酶傳代)。HEC中轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-Smad4組，同時把未做轉染處理的HEC記為Control組，具體轉染方法同Lipofectamine 2000脂質體轉染說明書。

1.3qRT-PCR測定HEC中Smad4表達Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞培養24 h，以每106個細胞添加1 ml的TRIzol將各組HEC裂解以后，與200 μl的氯仿混合后，吸取上層水相溶液，再與500 μl的異丙醇混合，低溫，高速離心后，用75%的乙醇洗滌RNA，用RNase-free水溶解后，測定吸光度(optical density,OD)值260 nm和OD 280 nm的比值，比值介于1.8～2.0之間。逆轉錄合成cDNA，反應條件為：25 ℃、5 min；42 ℃、60 min；75 ℃、5 min。 取cDNA，進行熒光定量PCR擴增，步驟同試劑盒說明書，用2-ΔΔCt法計算各組樣品中Smad4水平，GAPDH為參照。

1.4Westernblot測定HEC中Smad4表達Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞培養24 h，用預冷的PBS洗滌后，每個細胞瓶中添加含有PMSF的裂解液500 μl，放在冰上裂解30 min后，低溫高速離心10 min。把上清液轉移至EP管中，用BCA法檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳電壓為90 V，每孔上樣量為30 μg。用半干法把凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，100 mA電流轉膜50 min。用5%牛血清白蛋白封閉后與抗體孵育，Smad4一抗1 ∶600稀釋，GAPDH一抗1 ∶1 000稀釋，二抗1 ∶2 000稀釋，DAB顯色。對蛋白條帶進行半定量分析，目的蛋白同GAPDH內參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5MTT測定HEC增殖活性Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞種植到96孔板中，在第24、48、72、96小時取出培養板，在細胞內加MTT溶液，培養4 h，將上清液去掉，再添加DMSO，用酶標儀檢測每孔在490 nm的OD值。

1.6流式細胞儀檢測細胞周期Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞在轉染以后24 h，用胰蛋白酶消化，轉移到流式管內，低速離心10 min，把上清液去掉，添加75%甲醇，置于4 ℃過夜反應，低速離心10 min，加入PI，置于4 ℃反應30 min，流式細胞儀測定HEC周期。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞在轉染以后24 h，用胰蛋白酶消化，與400 μl的結合緩沖液混合后，再與PI和Annexin V-FITC反應后，流式細胞儀檢測HEC凋亡。

1.8Westernblot檢測細胞中CleavedCaspase-3、CDK4、CyclinD1蛋白水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞在轉染以后24 h，用胰蛋白酶消化，Western blot法檢測Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平，Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1一抗以1 ∶600稀釋，其他步驟同上。

1.9DCFH-DA法檢測細胞中ROS水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞在轉染以后24 h，用DCFH-DA法檢測細胞中ROS水平，步驟同ROS含量測定試劑盒，以Control組為1，分析各組細胞ROS水平。

2 結果

2.1細胞轉染后HEC中Smad4表達HEC中轉染pcDNA3.1-Smad4后，細胞中Smad4 mRNA和蛋白水平均升高，而轉染pcDNA3.1對HEC中Smad4 mRNA和蛋白水平沒有影響，見圖1、表1。

圖1 Western blot測定轉染后的HEC中Smad4蛋白表達情況

表1 各組HEC中Smad4水平

與Control組比較：*P<0.05

2.2Smad4對HEC增殖的影響HEC中轉染pcDNA3.1-Smad4后，細胞OD值降低，而轉染pcDNA3.1對HEC OD值沒有影響，見表2。過表達Smad4可以降低HEC的增殖活性。

2.3Smad4對HEC周期的影響HEC中轉染pcDNA3.1-Smad4后，細胞G0/G1期比例升高，而轉染pcDNA3.1對HEC周期沒有影響，見表3。過表達Smad4可以將HEC周期阻滯在G0/G1期。

2.4Smad4對HEC凋亡的影響HEC中轉染pcD-NA3.1-Smad4后，細胞凋亡率升高，而轉染pcDNA3.1對HEC凋亡率沒有影響，見圖2、表4。過表達Smad4誘導HEC凋亡。

表2 各組HEC OD值

與Control比較：*P<0.05

圖2 流式細胞儀測定Smad4誘導的HEC凋亡情況

表3 各組HEC周期

與Control組比較：*P<0.05

表4 各組HEC凋亡率

與Control組比較：*P<0.05

2.5Smad4對HEC中Caspase-3、CDK4、CyclinD1表達的影響HEC中轉染pcDNA3.1-Smad4后，細胞中Cleaved Caspase-3水平升高，CDK4、Cyclin D1蛋白水平下降，而轉染pcDNA3.1對HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平沒有影響，見圖3、表5。過表達Smad4誘導HEC中Caspase-3活化，減少細胞中CDK4、Cyclin D1蛋白表達。

圖3 Western blot檢測HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平

2.6Smad4對HEC中ROS水平的影響Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-Smad4組細胞中ROS水平依次為：1.00、(1.01±0.07)、(1.76±0.18)，3組比較差異有統計學意義(F=45.853,P=0.000)。HEC中轉染pcDNA3.1-Smad4后，細胞中ROS水平升高，而轉染pcDNA3.1對HEC中ROS水平沒有影響， 見圖4。過表達Smad4誘導HEC中ROS合成。

表5 各組HEC中Cleaved Caspase-3、CDK4、Cyclin D1蛋白水平

與Control組比較：*P<0.05

圖4 各組HEC中ROS水平

3 討論

本實驗的結果顯示，Smad4過表達后的HEC中CDK4和Cyclin D1蛋白表達水平降低，細胞周期被阻滯在G0/G1期，提示Smad4通過減少CDK4和Cyclin D1表達阻滯HEC周期，抑制HEC增殖；同時結果還表明，Smad4過表達后的HEC中Caspase-3活化增多，細胞凋亡率升高，提示Smad4可以通過激活Caspase-3的活化誘導HEC凋亡；Smad4誘導HEC中ROS水平升高，這可能是Smad4誘導HEC凋亡的機制之一。

Smad名字來源于果蠅Mad蛋白和線蟲Sma蛋白，Smad蛋白家族在信號轉導中發揮重要作用，是與轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)有關的效應因子，參與細胞內信號轉導過程，在哺乳動物體內發現了至少9種Smad蛋白成員，Smad4是目前確認的共同通道型Smad，是一種抑癌基因，可以與幾乎所有的活化途徑Smad蛋白相結合，形成低聚體的復合物，在TGF-β信號調節中發揮關鍵作用[8]。Smad4含有一個MH2結構域，MH2由β片層夾心、三環α螺旋和三螺旋束構成，這個區域的氨基酸序列高度保守，在分子識別中具有重要作用，而這個區域內蛋白與蛋白之間作用界面是突變發生的重要區域，多數腫瘤在該區域內均有不同程度的突變[9]。Smad4的異常表達與胰腺癌等腫瘤的發生有關，并且可以誘導細胞的凋亡，降低細胞的增殖能力[10]。TGF-β與HEC的生長和凋亡有關，而Smad4在增生期的HEM組織表達水平低于退化期的HEM組織，提示Smad4可能參與HEC的凋亡[6]。 本實驗結果證實了Smad4在HEM內皮細胞凋中的作用，這與上述研究結果一致。

細胞周期可以分為細胞間期和分裂期，而間期又可以分為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期)，M期是細胞分裂期，G0期是細胞停止分裂，處于發揮其生物學功能階段的細胞，細胞周期的調控與細胞內周期蛋白有關，其中CDK4和Cyclin D1表達減少可以誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，Cyclin D1能夠與CDK4形成復合物，誘導細胞進入S期[11]。研究[12]顯示，Smad4可以抑制子宮內膜癌細胞生長，把細胞周期阻滯在G0/G1期，發揮抗腫瘤作用。Caspase參與細胞凋亡調控，是一個半胱氨酸蛋白酶家族，幾乎參與所有的細胞凋亡信號轉導，其蛋白家族的成員組成一個類似瀑布的反應，誘導細胞凋亡的發生。Caspase-3是該蛋白家族的重要成員之一，在正常細胞和腫瘤細胞中其以沒有活性的酶原存在，而當誘導細胞凋亡的信號轉導至Caspase反應后，Caspase-3被激活，誘導細胞凋亡發生[13]。Smad4可以激活Caspase-3最終誘導乳腺癌、膠質瘤等細胞凋亡[14]。ROS廣泛存在于細胞內，其既可以作用一種信號轉導分子調控細胞生物學行為，又可以維持細胞內的氧化平衡，而當細胞內的ROS水平過度升高后，會打破細胞內的氧化平衡狀態，對細胞造成損傷，引起細胞凋亡發生[15]。本實驗結果證實Smad4可以通過提高HEC中ROS水平激活Caspase凋亡反應，通過影響細胞周期調控蛋白的表達抑制HEC增殖，這可能是Smad4抗HEC生長的機制。

綜上，Smad4在HEM生長中發揮抑制作用，Smad4可能通過阻滯細胞周期抑制HEC增殖，通過促進細胞中ROS積累激活Caspase凋亡反應誘導HEC凋亡發生，這對于研究Smad4在HEM發生中的作用機制奠定了基礎，為研究HEM發生的作用機制提供了參考。本實驗存在一定的局限性，Smad4具體的靶向作用機制尚未研究，Smad4的作用機制沒有在體內進行驗證，后續實驗將對上述部分進行探討。