甘氨酸轉運體1抑制劑M22對癲癇小鼠認知障礙的改善作用研究

林力峰，梁 維，劉 洲，冼文川，鐘望濤

癲癇是由于腦部神經元高度同步化異常放電而引起的慢性、反復發作的短暫性大腦興奮-抑制功能失調綜合征。其主要的臨床特性是發作性、重復性、刻板性與短暫性[1-3]；有文獻[4]報道30%～40%的癲癇患者均伴有不同程度的認知障礙。目前的抗癲癇藥物均不能明顯改善癲癇患者的認知功能損傷與多動障礙，有些藥物甚至能夠加重患者的認知損傷，并且加重多動障礙的發生[5-6]。

甘氨酸作為腦內最為重要的興奮性神經遞質，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)進而聯合作用于谷氨酸介導的神經傳遞。研究[7-8]表明NMDA受體的激活，對于學習記憶能力的維持以及長時程增強起著重要的作用。研究[9-10]表明，突觸間隙的甘氨酸水平又受突觸前膜的甘氨酸轉運體1(glycine transporter 1，GlyT1)調節，GlyT1抑制劑又可以提高NMDA受體周圍甘氨酸的濃度。因此可以間接通過抑制甘氨酸轉運體活性來激活NMDA受體，增強NMDA受體的活性。有研究[11]顯示在癲癇模型中GlyT1抑制劑2,4-dichloro-N-{[4-(cyclopropylmethyl)-1-(ethylsulfonyl) piperidin-4-yl] methyl}benzamide (M22)具有明顯的抗驚厥作用，并對于癲癇發作具有一定的治療作用。該文主要探究GlyT1抑制劑M22對于癲癇小鼠的認知功能障礙的改善作用及其主要作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑M22購自深圳MedChemExpress公司；甘氨酸購自上海威奧生物科技有限公司;實驗所需的一抗、二抗與戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)均購自美國Sigma公司。

1.2動物實驗動物為清潔級C57BL/6雄性小鼠50只(動物購自南京大學-南京生物醫藥研究院)，體質量25～30 g。動物飼養和實驗場所為廣東醫科大學實驗動物中心和廣東醫科大學神經病學研究所。小鼠的整體飼養在通風良好，光照周期為12 h晝夜交替，環境溫度(25±1) ℃，濕度為(50±10)%的恒定環境，并可以自由飲水攝食。動物實驗的所有操作在每天9:00～17:00 期間進行。所有動物實驗完全符合廣東醫科大學實驗動物中心的動物倫理學條例。

1.3癲癇模型的建立與動物分組在分組前，對實驗動物進行4 d 的水迷宮訓練，剔除存在學習記憶障礙的小鼠。然后將50只C57BL/6小鼠按照質量隨機分為3組，分別是空白對照組(Control,n=10)，模型組(Model,n=20)，M22組(M22,n=20)?？瞻讓φ战M小鼠腹腔注射等量的生理鹽水，模型組和M22組小鼠則是經過腹腔注射PTZ (30 mg/kg) 制備慢性點燃癲癇模型，連續腹腔注射PTZ 2周時間，并同時通過灌胃給予M22組小鼠 40 mg/(kg·d)的M22[按照0.1%(w/v)的比例將M22均勻分散在羧甲基纖維素中]。參照癲癇發作Racine分級標準：0級：無任何反應或表現出興奮癥狀；Ⅰ級：面部肌肉陣攣，包括動須、節奏性咀嚼、眨眼；Ⅱ級：伴隨Ⅰ級癥狀，并新添加節律性點頭；Ⅲ級：伴隨Ⅱ級癥狀，并新添加肌陣攣、伴隨身體直立；Ⅳ級：伴隨Ⅲ級癥狀，并新添加后肢站立，有強直陣攣發作；Ⅴ級：伴隨Ⅳ級癥狀，并新添加失去體位控制、跌倒。在癲癇模型點燃過程中觀察其癲癇發作情況；當達到Ⅲ級并持續3 d以上時，則被認為癲癇模型已經完全點燃。

1.4認知功能檢測利用水迷宮實驗測試小鼠的學習記憶能力，當連續給藥14 d后開始利用Morris水迷宮實驗進行檢測。Morris水迷宮實驗水溫控制在(20±0.5) ℃，加入二氧化鈦使得池水變為不透明的白色，以遮蓋實驗小鼠在水中的嗅覺和視覺。Morris水迷宮由一個圓柱型水池(直徑：80 cm；高：70 cm)和可移動站臺組成(直徑：8 cm)。實驗時使得水面高于平臺1cm。連續進行4 d訓練，每天開始時，將小鼠從任意一個象限面向池壁放入水中，每次讓小鼠游泳60 s來尋找隱藏的站臺。如果成功地找到站臺，則讓小鼠在站臺上停留15 s；如果60 s內未能成功找到站臺，則將小鼠牽引到站臺上同樣停留15 s。第5天則進行測試，去掉平臺并記錄小鼠在60 s內在目標象限的運動總路程、目標象限停留時間等指標。

1.5海馬HE染色觀察行為學測試以后，立即將小鼠處死，迅速取腦組織并采用4%的多聚甲醛進行固定，常規石蠟包埋，制成厚3 μm 的切片，進行常規蘇木精-伊紅(HE) 染色，光學顯微鏡下觀察海馬細胞形態變化。

1.6凋亡相關蛋白測定采用Westem blot法測定Bcl-2、Bax和細胞色素C(Cytochrome C，CytC)等凋亡相關蛋白的含量表達。低溫條件下取大鼠皮層腦組織，稱重后液氮勻漿。4 ℃條件裂解30 min，4 ℃、12 000 r /min離心10 min，取上清液；采用BCA法測定皮層組織的蛋白含量。采用SDS 聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；冰浴條件下轉膜2 h; 采用TBST 反復漂洗3 次；置于平緩搖床內，37 ℃條件下封閉孵育1 h；再用TBST 漂洗3 次加入Ⅰ抗后4 ℃孵育過夜；采用TBST 漂洗3 次后；加入熒光Ⅱ抗置于37 ℃平緩搖動孵育1 h；再一次TBST 反復漂洗3 次。然后進行凝膠圖像，并對數據處理系統分析。

1.7腦皮質GFAP和FGF-2蛋白表達的測定Westem blot法檢測腦組織的膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)的蛋白表達量。具體步驟如上所述。

1.8統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1水迷宮實驗結果Model組較Control組潛伏期顯著延長(P<0.05)，表明癲癇發作造成了實驗小鼠的學習認知功能發生障礙；當給予M22后，M22組與Model組相比潛伏期顯著降低(P<0.05)，明顯恢復到Control組水平，表明M22對于癲癇導致的認知功能障礙有顯著的改善作用。此外，Model組與Control組相比，穿越站臺次數與目標象限活動時間都明顯縮短(P<0.05)，當給予M22后M22組較Model組的穿越站臺次數與目標象限活動路程均明顯恢復到Control組水平。見圖1。

2.2海馬HE染色觀察海馬組織HE染色結果：Control組小鼠海馬神經元細胞形態完整，邊緣清晰，細胞核結構清晰并呈現圓形，染色質分布均勻；Model組小鼠海馬神經元細胞則出現細胞形態模型不清，結構出現不完整，海馬神經元出現不同程度的凋亡，染色質凝聚，細胞核輪廓消失；當給予M22后，小鼠海馬神經元細胞則出現恢復到Control組的水平，表明M22具有神經保護作用，能夠抑制神經元的凋亡，保護神經元細胞免受損傷。見圖2。

2.3大腦皮層凋亡相關蛋白表達量的測定通過Western blot檢測小鼠大腦皮層凋亡相關蛋白的表達量，見圖3。Model組小鼠大腦皮層的Bcl-2/Bax的比值較Control組顯著降低，當給予M22后，癲癇小鼠的Bcl-2/Bax的比值顯著升高；此外，Model組小鼠大腦皮層的CytC蛋白表達量較Control組顯著升高，當給予M22后，癲癇小鼠的CytC蛋白表達量顯著降低；以上結果均表明癲癇會加速神經元凋亡，而M22具有神經保護作用。

2.4大腦皮層GFAP和FGF-2蛋白表達量的測定GFAP和FGF-2蛋白的表達見圖4：Model組小鼠大腦皮層的GFAP蛋白含量較Control組顯著升高；當給予M22時，小鼠大腦皮層的GFAP蛋白含量顯著回調。此外，Model組小鼠大腦皮層的FGF-2蛋白含量較Control組顯著降低；當給予M22時，小鼠大腦皮層的FGF-2蛋白含量顯著升高。

3 討論

癲癇是一種常見的神經系統疾病，病因復雜；但是反復的癲癇發作可導致大腦功能損傷，尤其易導致認知功能障礙。在癲癇患者中，認知功能損傷的發生率大約在30%～40%。此外，在癲癇疾病相關研究中，PTZ可誘導動物產生和人類癲癇患者相似的行為學和神經病理學改變，且PTZ并不具有神經毒性作用，因此被廣泛用于抗癲癇藥物研究及其相關發病機制研究[3]。

圖1 水迷宮實驗結果A:穿越站臺次數;B：逃跑潛伏期；C：目標象限活動時間；與Control組比較：*P<0.05

圖2 海馬組織HE染色 ×50

圖3 小鼠大腦皮層凋亡相關蛋白的測定與Control組比較：*P<0.05

圖4 大腦皮質GFAP和FGF-2蛋白表達的測定與Control組比較：*P<0.05

目前，在動物學習記憶能力評價中常用的實驗是Morris水迷宮實驗[12]，因此本文在評價PTZ誘導的癲癇小鼠的認知功能是采用Morris水迷宮實驗進行評價，結果表明PTZ導致的癲癇小鼠的潛伏期較Control組顯著增加，而穿越平臺次數和目標象限停留時間均顯著降低，表明PTZ導致的癲癇小鼠的認知功能顯著降低。當給予PTZ導致的癲癇小鼠M22后，其Morris水迷宮實驗相關評價指標顯著回調到Control組水平，表明M22對于PTZ導致的癲癇小鼠的認知功能障礙具有顯著的改善作用。

研究[13]表明癲癇發作后，可導致海馬神經元凋亡、壞死；而海馬神經元與學習認知功能具有顯著的相關性，海馬神經元的損傷可能是其發生認知功能障礙的主要原因。因此，本文對其海馬組織進行HE染色觀察，結果顯示Model組小鼠的海馬神經元細胞出現大量壞死，當給予M22后，其神經元壞死減少，表明M22具有神經保護作用。為了進一步評價神經元的凋亡情況，對其大腦皮層的相關凋亡蛋白進行測定，結果表明Model組小鼠大腦皮層的Bcl-2/Bax的比值較Control組顯著降低，而CytC蛋白表達量較Control組顯著升高，當給予M22后，癲癇小鼠的Bcl-2/Bax的比值與CytC蛋白表達量均顯著回調；以上結果均表明癲癇會加速神經元凋亡，而M22具有神經保護作用。

此外，星型膠質細胞對于腦部環境起著重要的控制作用，對于胞外鉀離子和谷氨酸的堆積有著重要的調控作用。GFAP是星型膠質細胞激活的特異性標志物。星型膠質細胞激活表明神經細胞受到損傷，因此GFAP經常作為評價腦損傷的一個重要指標[14]。本研究測定了大鼠皮層組織的GFAP蛋白量的表達，結果顯示Model組GFAP蛋白表達量較Control組顯著升高，當給予M22后，其表達量顯著降低，表明M22具有神經保護作用。此外，FGF-2為一種抑制細胞凋亡蛋白[15]，在Model組顯著降低，當給予M22后顯著回調，表明M22可抑制細胞凋亡，具有神經保護作用。

綜上所述，甘氨酸轉運體1抑制劑M22可以改善癲癇小鼠認知功能障礙，提高癲癇小鼠的學習、記憶能力，抑制神經元細胞凋亡，為癲癇或者難治性癲癇患者提供新的選擇。