肝纖維化發生上皮—間葉質轉化(EMT)的分子機制研究進展*

余亞平 陳芝蕓 葉 蕾

浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江省杭州市 310006

肝纖維化(Hepatic fibrosis)是多種原因引起的慢性肝損傷之后組織修復過程中的病理改變，是慢性肝炎轉變為肝硬化過程的樞紐環節。其病理學基礎是活化的肌成纖維樣細胞(Myofibroblastic-like cell,MFLC)增多，細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)大量沉積。肝纖維化尚有逆轉至正常的可能,故阻斷和延緩肝纖維化的發展,是治療慢性肝病的重要策略。

越來越多的證據表明[1]，間充質細胞在肝纖維化形成過程中起著重要的作用，而上皮—間葉質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是間充質細胞的重要來源之一。EMT即上皮細胞失去其上皮表型特征而逐漸獲得間質細胞表型特征的過程。通過EMT，具有上皮表型的靜止期HSC(Quiescent hepatic stellate cell，Q-HSC)、肝細胞、膽管上皮細胞以及竇狀內皮細胞等可成為具有間質細胞表型的MFLC，并參與肝纖維化發生發展。但EMT是可逆的，即間質—上皮轉化(MET)。EMT/MET 這兩個可逆過程之間是否平衡是決定慢性肝病的進展、療效及預后的重要因素。如果 EMT占優勢則肝纖維化進展，反之，MET占優勢則纖維化得到修復逆轉[2]。

EMT的發生與多種蛋白分子、微環境及Micro-RNA等有關，涉及多個信號轉導通路和復雜的分子機制，EMT在肝纖維化中的作用越來越受到重視，本文對EMT與肝纖維化相關的主要分子機制研究進行綜述。

1 EMT的分子生物學機制

在EMT過程中，上皮標志物的緊密連接蛋白ZO-1、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等表達下調；間質標志物的波形蛋白、β-連環蛋白(B-catenin)、α-平滑肌肌動蛋白、N-鈣黏蛋白、成纖維細胞特異性蛋白1(FSP1)等表達上調[2]。

EMT的誘導因素眾多：細胞外界刺激，如多種細胞因子和生長因子，缺血缺氧、炎癥刺激等，其中生長因子在誘導肝纖維化EMT中發揮重要作用。多種細胞生長因子如過氧化物酶體增殖激活受體、腎素—血管緊張素—醛固酮系統的caspases、上皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、血管、內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子-β家族 (Transforming growth factor-βs，TGF-βs)等，與細胞膜特異性受體結合后均可觸發細胞內信號級聯反應，促使細胞發生EMT。

EMT的誘導過程受到核轉錄因子的調控。Snail、Twist、ZEB等各種轉錄因子往往通過不同的機制同時被激活，來抑制E-cadherin的表達。這些轉錄因子之間相互作用、相互調節，協同調控EMT的整個過程[3]。

2 肝纖維化中EMT的信號通路

2.1 TGF-β信號轉導通路 TGF-β1是最重要的致肝纖維化因子[4]， Smads 是其主要信號轉導途徑。在各種損傷因子作用下，肝臟內 TGF-β1表達大量增加，與其Ⅰ、Ⅱ型受體綁定后引起Smad 2/3磷酸化；磷酸化的Smad結合體募集Smad 4并進入細胞核，調節ZEBl、ZEB2、Snail、Slug等轉錄因子，促進EMT發生。使用TGF-β1無血清培養基刺激原代小鼠/大鼠肝細胞后可見較多肝細胞死亡,細胞數量減少,形態由多邊形向梭形轉變，間質標志的α-SMA、N-鈣黏蛋白、波形蛋白表達顯著增加,上皮標志E-鈣黏蛋白表達下降，且隨TGF-β1濃度增加而呈劑量依賴性[5]。運用siRNA阻斷TGF-β1信號通路可阻斷了肝細胞的EMT現象。TGF-β1/Smad通路激活后可誘導膽管細胞、肝細胞以及肝卵圓細胞發生EMT，此通路可能是肝臟發生纖維化時誘導EMT的主要調控機制之一，幾乎調控所有肝臟細胞發生轉化。

TGF-β1還能通過活化絲裂原激活蛋白激酶，Rho家族的鳥苷三磷酸酶和磷脂酰肌醇3激酶促進EMT[6]。TGF-β還通過RhoA調節下游的Rho相關蛋白激酶(ROCK)、LIM Kinase(LIMK)和CoFILIN等，導致EMT，并可通過抑制LIMK阻斷TGF-β通過基質細胞外基質蛋白層的侵襲，抑制Rho GTPases的活化則逆轉EMT[7]。其他EMT轉錄調節因子如ZEBl，也受到TGF-β1-Smad方式的調節。

2.2 Notch信號通路 Notch信號轉導通路由受體、配體、其他的效應物、CSL(一種DNA結合蛋白)、調節分子等組成。Notch與其配體Jaggedl結合后進入細胞內，在胞質內被釋放出來，進入細胞核與CLS結合，調控EMT相關基因表達。Notch信號通路調控EMT過程主要是通過誘導Snail的表達來實現的，Snail蛋白也可以反過來調控Notch信號通路表達，進而在EMT過程中發揮重要的作用[8]。而Snail啟動子的活化賴于TGF-β/Smad通路中Smad 3/Smad4的結合。Notch-1與TGF-β1在肝纖維化的發生過程中具有協同作用，兩者均可能通過上調Snail基因抑制E-cadherin的表達進而啟動EMT[9]。阻斷 Notch信號能抑制TGF-β信號，抑制TGF-β信號也可阻斷Notch信號。

Notch通路激活后，γ-分泌酶可以引發一系列的蛋白級聯反應使Notch細胞內結構域(Notch intracellulardomain，NICD)活化[10]，活化后的 NICD進入細胞核內，可以使一些轉錄抑制因子轉變為轉錄激活因子, 調控下游 EMT相關基因的表達。在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化模型中，通過γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號激活，可降低Snail、波形蛋白和TGF-β1的表達，同時增強E-鈣黏蛋白的表達[11]。體外實驗進一步發現，DAPT能抑制大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)的EMT過程， Notch 2和Notch 3受體以及Hey2和HeyL靶基因的表達顯著減少[8]。提示Notch信號轉導與肝纖維化有關，DAPT治療對肝細胞有保護作用，并改善肝纖維化。因此，抑制γ-分泌酶成為肝纖維化治療的新希望之一。

2.3 Wnt信號通路 Wnt信號通路通過多條途徑影響肝纖維化的發生發展，EMT是其中的重要途徑之一。畢婉蓉等[5]研究表明Wnt信號通路參與了小鼠HF的過程,其機制可能是在實驗性小鼠肝上皮細胞中通過下調內源的某些自分泌信號抑制因子,而誘導細胞啟動EMT程序。經典的Wnt/β-catenin信號途徑參與了E-鈣黏素的調節以及EMT。Wnt 蛋白與Frizzled、LRP 相關受體結合,可抑制GSK-3β的活性從而影響了β-catenin 的磷酸化及降解[12]，促使β-catenin轉移至細胞核內，與Tcf/Lef 結合，激活靶基因轉錄[13]，從而加速肝內細胞EMT以及纖維化的發展。

經典的Wnt通路還和其他通路相互作用。研究表明，TGF-β3通過上調Lef -1的活性誘發EMT，而TGF-β1能上調β-catenin/Lef-1。Lef 協同Smad3以及β-catenin從細胞質向細核內的轉移在EMT中發揮了重要作用。Notch信號途徑能明顯上調經典Wnt信號途徑的抑制劑-GSK-3β的活性，因此GSK-3β被認為是兩條信號通路的一個重要結合點。除了TGF-β外，EGFR的胞漿部分能與β-catenin的核心區域緊密結合，降低E-cadherin/β-catenin復合物的穩定性，使E-cadherin介導的黏附功能下降。HGF、FGF等在體外誘導干細胞向肝系細胞方向分化，然后在分化中期(13d)、成熟期(17d)兩個時間點動態抑制細胞Wnt/β-catenin信號以降低其EMT水平，可有效促進干細胞肝臟組織結構分化[14]。

Wnt 非經典信號通路較多，主要包括Wnt/Ca2+通路和細胞急性通路(Planar cell polarity pathway， PCP)。Tomonari等[15]研究發現pSTAT3表達與EMT和卷曲2(FZD2)狀態顯著相關，STAT3可能受Wnt5/FZD2和IL-6/JAK2信號通路的調控，在EMT中起重要作用。PCP通過激活 Dvl、小G 蛋白(Rho或者 Rac)等從而調節 JNK 信號來發揮作用。

Wnt 非經典通路與經典通路之間的相互關系卻還不十分明確。有研究發現Wnt/β-catenin信號通路激活后，可上調大鼠HSC-T6細胞活性，但Wnt/β-catenin信號通路激活后，Wnt/Ca2+信號通路可能不受相關影響。在另外的研究中發現Wnt/Ca2+信號通路能夠對Wnt/β-catenin通路起到抑制的作用。

2.4 Hedgehog(Hh)信號通路 Hh信號通路由 Hedgehog配體蛋白(Hh)、兩個跨膜受體：Pmched(Ptc)和Smoothened(Smo) 、一些中間傳遞分子及下游轉錄因子Gli家族等構成。Hh通路的激活通過EMT調節纖維化發生[16]。NAFLD患者中表達EMT標志物的Shh生成細胞和Hh應答性導管細胞的數量與肝纖維化同時增加，Hh介導的EMT在NAFLD中參與了肝硬化的發病過程[17]。膽汁淤積性纖維化過程中膽上皮和基質的重塑，與過度激活Hh通路有關，添加Hh中和抗體共培養可阻斷EMT和細胞遷移，避免向慢性膽汁淤積性纖維化的進展[18]。體外培養的HSC轉變為肌成纖維細胞HH信號通路被激活,發生EMT及 Notch信號肽增加[16]。封閉肌成纖維細胞Notch信號, Hh通路激活受抑制,導致MET,抑制Hh通路而抑制 Notch 信號,誘導MET,因此Notch 和Hedgehog 通路相互作用控制著成熟肝修復中調控EMT/MET。

2.5 整合素信號通路 整合素表達增加與肝纖維化進展一致，其表達水平增加與HSC活化和血管新生有關，并與間質重建程度平行。整合素在誘導肝纖維化EMT的過程中涉及多種信號通路。整合素相關激酶(Integrin-linked kinase，ILK)和黏著斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)是其中的關鍵信號分子。

ILK活化后能磷酸化P13K/Akt信號通路中的Akt，經磷酸化作用及其他信號通路對ZEB、Snail、E-鈣黏蛋白、NF-κB、β-catenin 、MMPs-9和細胞周期蛋白等多種EMT相關因子的表達進行調節。另外，P13K/Akt激活后，該通路的效應分子GSK-3失活，導致β-catenin泛素化失敗，促使β-catenin轉移至細胞核內，與Tcf/Lef 結合，激活Wnt/β-catenin通路。另有研究認為ILK可能是TGF-β1-Smad通路下游的效應因子，TGF-β1-Smad激活后，ILK的表達增加，導致E-鈣黏蛋白的丟失和FN 的表達與聚積，阻斷ILK則可逆轉以上改變，并能部分抑制TGF-β1誘導的MMP-2表達，故認為阻斷TGF-β1-Smad-ILK信號通路中的任一環節，可以控制肝纖維化的發生發展。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，在整合素介導的細胞信號中起關鍵作用。研究證明FAK控制EMT，E-鈣粘蛋白、結締組織血小板和細胞角蛋白的表達是該程序的重點[19]。FAK拯救通過細胞外信號相關激酶和Akt依賴的信號級聯，并觸發Snail1基因的表達。這些發現證實FAK是胚胎細胞中依賴Snail1的EMT的新的調節因子。整合素和ECM結合或細胞內的信號分子均可使FAK自身磷酸化，活化的FAK能夠激活多條信號轉導通路，包括Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-P13K/Akt及FAK-Wnt/β-catenin信號通路，TGF-β誘導的EMT也需要FAK信號轉導。Patricio等[20]在細胞外基質調節肝細胞對成纖維細胞脫分化和轉化生長因子β誘導的細胞凋亡的敏感性研究中，發展干燥的硬膠原通過Src激活FAK，導致Akt和細胞外信號調節激酶(ERK)1/2途徑的激活。通過抑制Akt或Src，EMT可通過阻斷ERK1/2通路而被廢除。

3 小結

目前對于肝纖維化，因為欠缺有效的治療手段，進而可能導致病情進展為肝硬化、肝功能衰竭，甚至肝癌，最終死亡。EMT靶向治療為肝纖維化靶點治療開辟了新的道路，其中EMT的逆轉是關鍵。但EMT的發生涉及多個信號轉導通路和復雜的分子機制。隨著分子生物學技術的不斷提高，參與肝纖維化形成的多種細胞因子及信號通路機制被逐漸闡明，這為開展分子靶向治療提供了依據。但許多靶向治療方法雖已被證實，但仍局限于動物實驗中，未應用于臨床治療，且仍有一些信號傳導通路機制尚未完全明了，有待今后更多的深入研究。