環丙沙星-固體脂質納米粒的制備及抗菌效果

陳勝廣, 馬俊花, 王菁楠, 朱鴻玲, 顧明君

(上海市浦東新區公利醫院內分泌科，上海 200135)

近年來，由于藥物耐藥性、組織分布不均，以及毒性等，藥物的應用受到越來越多的限制。克服這些問題的方法之一就是開發合適的載藥系統[1-2]。不同特性脂質合成的固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles, SLNs)已受到極大的關注。SLNs具有眾多優點，如： 控制藥物釋放和靶向、提高藥物穩定性、增強藥物分散性、提高藥物有效載荷、載體無生物毒性、能夠大規模生產[3-7]。重要的是，由生理脂質和表面活性劑組成納米顆粒已通過FDA批準。被批準用于臨床應用[8]。因此，它們作為潛在的藥物載體越來越受到重視，尤其是對于水溶性差的藥物[9-13]。本課題組研究SLNs搭載脂溶性藥物環丙沙星并進行表征。

環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)對革蘭陽性和陰性細菌有均有很好療效的廣譜抗生素。但由于自身的耐藥、腎臟損害等缺點，限制了臨床應用。本研究的目的是設計合成環丙沙星固體脂質納米粒(CIP-SLNs)，進行表征。并檢測其抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

環丙沙星(CIP)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司。膽固醇和吐溫-80購自中國上海國藥化學試劑有限公司。乙醇、丙酮購自國藥集團化學試劑有限公司(中國上海)。雙蒸水由Millipore(Bedford，MA)Milli-Q?系統制備透射電鏡，所有其他化學品均為分析純。

1.2 CIP-SLNs制備

157mg的膽固醇溶解在12mL的丙酮/乙醇(體積比/1∶3)溶液中，形成油相；環丙沙星溶解于114ml含1%(v/v)吐溫-80的水溶液中，20℃下，600r/min轉勻速攪拌，形成水相。油相逐滴加入水相。1200r/min轉速，75℃下繼續攪拌2h。0℃冰上繼續攪拌2h。收集乳化液，20000r/min離心2h(Avanti J25 centrifuge, JA 25.50 rotor, Beckman Coulter)，去上清液，4℃雙蒸水洗滌后再次離心，沉淀再次懸浮后冷凍凍干，稱質量，得到CIP-SLNs納米顆粒，見圖1。4℃保存備用。

1.3 環丙沙星標準曲線建立

將標準重量的環丙沙星樣品溶于乙酸/乙醇(體積比1∶9)溶液中，依次將環丙沙星濃度設為1.25、2.5、5、7.5、10、15μg/mL，使用紫外-可見分光光度計(UV-vis)在280nm處測定環丙沙星的吸光度值(A280)。對每個濃度重復測量3次，取均值。以吸收值為縱坐標，濃度為橫坐標生成標準曲線。

1.4 透射電鏡掃描分析

蒸餾水稀釋CIP-SLNs，置于覆有硝化纖維素的銅網格上，形成一層薄薄的液膜，樣品用2%磷鎢酸鈉負染10min，然后自然風干。用透射電鏡(日本東京Jeol1230)觀察CIP-SLNs的形態特征。

1.5 粒徑和Zeta電位分析

在25℃下使用Malvern Nano-ZS 90激光粒度分析儀測定CIP-SLNs的粒徑和Zeta電位。將CIP-SLN分散于ddH2O中，按操作說明進行3次粒徑測量，取平均值。用同樣的儀器測量Zeta電位。

1.6 分散性研究

在PBS(mol/L)中放入等量的CIP或CIP-SLN，以觀察其分散性。稱量4mg CIP和對應質量的CIP-SLNs置于5mL離心管中，4mL PBS懸浮。渦旋1min后，試管靜置4h觀察沉淀現象。

1.7 載藥率和包封率

在合成過程中，收集所有上清液。測量計算其所含CIP質量，根據上清液中CIP的含量和總投入量，計算包封率(encapsulation efficiency, EF)。將稱重的CIP-SLNs樣品置于燒瓶中，用含10%乙酸(V/V)的乙醇完全溶解，計算其中所含CIP濃度。載藥率(drug loading, DL)和EF可按下式計算。

1.8 紫外-可見光譜研究

用紫外-可見光譜(UV-VIS)測定說明，用Cary 50(Varian，Victoria，Australia)紫外-可見吸收分光光度計測定納米顆粒紫外-可見光譜，以特征吸收峰證明納米核中CIP完整存在。將CIP、SLNs和CIP-SLNs溶于含10%乙酸(V/V)的乙醇中，分別測定光譜。

1.9 緩釋研究

體外藥物釋放采用透析膜法[14]。簡言之，37℃ 的PBS(pH7.4)受體介質。取一定量的CIP-SLNs(20mg)，溶于20mL ddH2O中，將CIP-SLNs分散液放入透析膜袋中。袋子浸入600mL(含1%吐溫-80PBS中)，37℃水浴，100r/min振蕩。在指定的時間間隔內更換相同體積(4mL)的樣品。通過紫外-可見分光光度計算所取樣品中CIP含量，計算累積釋放率。重復測定分3次。

1.10 抑菌試驗

將大腸桿菌ATCC 25922接種在LB培養基(10g胰蛋白酶原、5g酵母提取物、10g NaCl、1L去離子水)培養。然后將單個菌落接種到50mL的LB培養基中，在37℃條件下，200r/min的轉速在HZQ-QX型軌道振動培養箱(哈爾濱東聯電子有限公司)培養過夜，將大腸桿菌稀釋至106cfu/mL。分別為大腸桿菌組、大腸桿菌+SLN組、大腸桿菌+CIP組、大腸桿菌+CPX-SLN組。采用二倍稀釋法測定其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concertration, MIC)，各組濃度分別稀釋至6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.005μg/mL，37℃搖床過夜，觀察抑制可見細菌生長的最低藥物濃度，澄清的肉湯培養基所對應的濃度即最低抑菌濃度。

2 結 果

2.1 CIP標準曲線

逐步稀釋的CIP濃度分別為： 1.25、2.5、5、7.5、10、15μg/mL。通過紫外-可見光譜測定吸收值見表1。根據線性方程進行數據擬合并得到方程組：y=0.1345x+ 0.0135，R2=0.9991。

表1 環丙沙星標準曲線

2.2 透射電鏡分析

透射電鏡圖片顯示CIP-SLNs呈球形(圖2A)，直徑40～70nm，這同粒度分析結果相似。納米粒邊界清晰，未見聚集現象，相對分散良好，見圖2。

2.3 粒徑和Zeta電位分析

納米粒的Zeta電位為(-21.8±1.3) mV(圖2B)。動態光散射顯示CIP-SLNs粒徑為(171±11.4) nm。該結果同TEM結果相似，但大于上述結果。見圖2。

圖2 環丙沙星-固體脂質納米粒的表征Fig.2 Characterization of CIP-SLNsA： 環丙沙星-固體脂質納米的透射電鏡掃描分析；B： 環丙沙星-固體脂質納米的Zeta電位；C： 環丙沙星-固體脂質納米的粒徑分布

2.4 分散性分析

CIP是一種疏水性化合物，不溶于水溶液。為了證實載藥體系能夠增加CIP的分散性，本研究將等量的游離CIP和CIP-SLN懸浮在等量的PBS中。渦旋1min，靜置4h后觀察到游離CIP和SLNs-CIP在PBS中的分散。可以看出，CIP-SLN在PBS中分散穩定，靜置4h后納米粒沉淀很少，而CIP靜置 4h 后管底沉淀明顯，因此，將CIP嵌入SLNs納米結構中提高了CIP的分散性，見圖3。

圖3 環丙沙星和環丙沙星-固體脂質納米粒分散性Fig.3 Solubility study of free CIP and CIP-SLNs inPBSA： 環丙沙星；B： 環丙沙星-固體脂質納米粒

2.5 載藥率和包封率

根據前述(2.1項)已獲得的CIP標準曲線方程(y=0.1345x+0.0135，r2=0.9991)，對上清液CIP的含量進行測量，計算出的DL和EF分別高達31.10%和77.54%，能夠滿足下一步實驗要求。

2.6 紫外-可見光譜分析

將CIP-SLNs溶于含10%乙酸的乙醇溶液中，其吸收強度在280nm處呈現出與游離CIP相同的峰，但在SLNs中未觀察到特征性的CIP峰，這表明CIP在合成過程中仍保持完整，并被包裹在SLNs的納米核中，見圖4。

圖4 環丙沙星、固體脂質納米粒和環丙沙星-固體脂質納米粒的紫外-可見光光譜Fig.4 Ultraviolet-visible spectral of CIP, SLNs, CIP-SLNs

2.7 體外緩釋

本實驗為模擬此類制劑在生物體內釋放條件，選擇pH7.4的PBS作為釋放介質，但CIP難溶于水，無法滿足體外釋放要求的漏槽條件，所以在受體介質中使用1%吐溫80作為表面活性劑。促進其在介質中的漏槽條件。SLNs-CIP的體外藥物釋放曲線呈現雙相模式，起初是突釋，然后是持續釋放。釋藥機理可分為藥物擴散、聚合物基質膨脹、聚合物侵蝕或降解。在實驗條件下，CIP-SLNs在72h 的累計釋放度為78.6%，見圖5。

圖5 環丙沙星-固體脂質納米粒在PBS中的緩釋Fig.5 In vitro release studies of CIP-SLNs were performedin PBS

2.8 抑菌試驗

培養液澄清，無渾濁、沉淀表明無細菌生長，培養液渾濁程度表明細菌生長豐度。-： 無菌；+： 少量細菌；++： 許多細菌；+++： 大量細菌。大腸桿菌組和大腸桿菌+SLN組培養液明顯渾濁；大腸桿菌+CIP組的MIC為1.6μg/mL，大腸桿菌+CPX-SLN組的MIC為0.8μg/mL，后者低于前者。結果表明，CPX-SLN的抗菌效果優于單純的CIP，見圖6。

圖6 環丙沙星-固體脂質納米粒和環丙沙星的最低抑菌濃度Fig.6 The MIC of CIP and CIP-SLNs-： 無菌; +： 少量細菌; ++： 許多細菌; +++： 大量細菌

3 討 論

環丙沙星是喹啉羧酸衍生物，有廣譜抗菌效果[15-17]，但因其耐藥性，特別是泌尿道細菌耐藥越來越普遍[18-20]，且其不溶于水的特性及臟器損害作用均限制其臨床使用[21-22]。SLN常用制備方法有微乳法、高壓乳勻法、乳化蒸發-低溫固化法、薄膜超聲分散法，每種方法都有各自的優劣性。本研究采用乳化-低溫固化法，此方法不需要特殊的設備，能耗低，制備的納米粒粒徑較小、均一，載藥量和包封率較高。作為一種非常有前途的藥物載體，SLNs具有低毒、控釋、靶向、高載藥量等優點。近年來，越來越多的研究集中在使用納米顆粒作為載體來增強藥物的抗菌效果，包括環丙沙星，但關于SLN搭載環丙沙星的研究較少，用于臨床的研究更是少之又少。

攪拌速度是影響粒徑的重要因素，如果攪拌速度過慢，粒徑具有增大的趨勢，放置后穩定性較差；速率過快，在乳化的過程當中，產生泡沫較多，容易外濺，增加損耗，影響了表面活性劑的乳化效果，故本實驗采取1200r/min[23]。低溫固化過程，降溫必須迅速，否則易導致不能瞬時固化，使納米粒具有一定的軟黏性，在相互碰撞的過程中易粘連，使粒徑增大且易沉降。

本研究使用SLNs搭載環丙沙星。在確認設計方案后，進一步對納米體系表征。SLNs-CIP的粒徑是(171±11.4) nm。它大于TEM掃描結果。可能是因為TEM實在干燥情況下測得的；DLS是在潮濕狀態下測得的[14]。Zeta電位是(-21.8±1.3) mV，根據雙分子層原理，Zeta電位的大小與納米粒體系的穩定性密切相關，Zeta電位控制在-20～-45mV能夠得到穩定的SLNs，CIP-SLNs所帶電位符合要求，該電位保證納米粒產生排斥效應，防止聚集，并增加穩定性。此外，UV-VIS分析說明，環丙沙星在合成過程中波峰特征未改變，保持了完整性，并被包裹到納米粒中。同CIP相比,SLNs-CIP在PBS中具有更好的分散性。體外緩釋顯示，CIP-SLNs可持續釋放至72h。并呈雙相模式，初始的突釋可能源于納米粒表面的環丙沙星，此后的緩釋源于納米顆粒內藥物擴散導致的緩慢而均勻的釋放。在實踐中兩者均具有重要意義，突釋可以盡快達到血藥濃度。CIP-SLNs的載藥率和包封率均達到要求。

大腸桿菌ATCC29522體外抑菌試驗表明，CIP-SLN的MIC低于CIP。CIP的MIC是1.6μg/mL，這同既往研究結果一致[24]。然而CIP-SLN的MIC是0.8μg/mL，顯示固體脂質納米粒提高了環丙沙星的抑菌效果。

本研究成功制備了CIP-SLNs納米顆粒，初步研究了其抑菌效果，但具體的機制還有待進一步研究。