氯化鋰對牙髓干細胞增殖與分化的影響

李樂楓，蔣備戰

(同濟大學附屬口腔醫院牙體牙髓病學教研室-上海牙組織修復與再生工程技術實驗中心，上海 200072)

Wnt/β-catenin信號通路與牙胚生長發育、牙冠形態發生以及牙根發育形成的過程密切相關，它在牙上皮的增殖發育以及成牙本質細胞的生長分化過程當中都起到了重要的作用[1-2]。相關研究表明，無機化合物氯化鋰作為該經典信號通路的激活劑，具有上調該通路的能力；通過加入氯化鋰(LiCl)對該通路進行激活，能促進細胞的增殖與骨向分化[3]。而對于牙髓牙本質復合體受損傷后的蓋髓治療過程中，牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)受蓋髓材料的作用，具有形成修復性牙本質的潛能[4]。然而，氯化鋰對于牙髓牙本質復合體再生的作用尚未有深入研究。本課題擬從細胞研究層面上探究Wnt/β-catenin通路的激活劑氯化鋰對牙髓干細胞增殖與分化的影響，為蓋髓材料的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低糖型DMEM培養基、胎牛血清、谷氨酰胺、青鏈霉素購自美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、CO2恒溫孵箱購自美國Thermo公司；低速離心機購自德國Eppendorf公司；YJ-875型超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠；倒置相差顯微鏡及照相系統購自日本Nikon公司；10cm培養皿及15、50mL離心管購自美國Corning公司；抗人(Vimentin、Cytokeratin 19、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146)抗體、山羊抗兔二抗購自Abcam公司；氯化鋰、CCK-8試劑盒、茜素紅染液購自南京凱基公司；膠原酶、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉購自Sigma公司。

1.2 牙齒樣本的收集

本實驗經過同濟大學倫理委員會批準(倫理審查編號： 2018-012)，嚴格遵照有關人類細胞提取及研究應用規定進行操作。所有患者均來自同濟大學附屬口腔醫院口腔頜面外科。與患者進行充分溝通交流，介紹實驗內容及目的，得到知情同意后，收集因正畸拔除的前磨牙或智齒用作原代培養。所選患者年齡為18～25歲，無系統性疾病，無牙齒發育異常，口腔衛生狀況良好。收集的牙齒均牙根發育成熟，牙體無齲損，無牙髓及根尖周疾病。

1.3 原代細胞培養及細胞的克隆分離

使用高速渦輪機及TF-21金剛砂車針于新鮮拔除的前磨牙或智齒釉牙本質界處制備深溝，深度未及髓腔，制備后將離體牙浸入無菌PBS緩沖液。在超凈臺內，用青鏈霉素混合溶液反復沖洗后，使用無菌器械將離體牙冠部撬開，暴露牙髓組織，使用拔髓針將冠髓及根髓取出，放入60mm細胞培養皿加入含青鏈霉素混合溶液的無菌PBS緩沖液，使用無菌眼科剪將組織充分剪碎后，加入3mg/mL膠原酶。隨后將培養皿放置于5% CO2孵箱37℃孵育30min。終止消化，離心半徑10cm，1000r/min離心5min，棄上清液，沉淀物用含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸，將酶消化后的組織塊在培養皿中貼壁，加入培養液并置于37℃、5% CO2培養箱。每72h換液，每日觀察細胞爬出情況。待爬出的細胞達到80%融合時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，傳代培養，隔天常規更換培養液。選擇生長狀態良好的第3～5代細胞用于后續實驗研究。

1.4 人牙髓干細胞來源分析

將生長狀態良好的第2代DPSCs以5×104個/孔接種至已放好細胞爬片的24孔細胞培養板，待第2天細胞貼壁后進行波形蛋白(Vimentin)、細胞角蛋白(Cytokeratin)免疫熒光實驗分析，操作步驟如下： 用PBS浸洗細胞爬片3次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定爬片15min后使用0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫下處理20min；PBS漂洗后山羊血清室溫封閉30min；吸水紙吸掉封閉液，每張爬片滴加足夠量的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中室溫孵育1h，PBST浸洗爬片3次，每次3min；滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST漂洗，洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 流式細胞術檢測細胞來源

收集對數期生長的第2代DPSCs，40μm細胞濾網過濾，制備單細胞懸液，調整細胞濃度到1×107個/mL；流式細胞管內加入400μL細胞懸液并分別加入抗體各10μL： 抗人CD34、抗人CD45、抗人CD90、抗人CD105、抗人CD146，設置對應的陰性對照組；避光條件下于冰上孵育30min，離心半徑10cm，1000r/min，離心5min后去除上清液，PBS清洗細胞并重懸至500μL，流式細胞術檢測細胞來源。

1.6 CCK8法檢測LiCl對DPSCs細胞增殖的影響

配制濃度為0.1、1.0、2.5、5.0、10mmol/L的LiCl條件培養液，均含有10%胎牛血清與1%青霉素鏈霉素混合液。使用胰蛋白酶將第3代DPSCs消化后制備細胞懸液，以2×103個/孔的密度接種于96孔板，于37℃、5% CO2培養箱中培養24h，待80%融合生長后，將各組樣本孔內培養液換為上述配制好的LiCl條件培養基，正常DMEM培養基作為對照組，每組設置5個復孔，每孔200μL，將細胞置于培養箱中繼續培養，隔天換液。分別于第1、3、5、7天取出檢測組，棄掉原培養液，PBS清洗1次，加入含有10% CCK-8試劑的100μL PBS，孵育箱孵育2h取出酶標儀測定各孔450nm處吸光度值(A450)，記錄結果，以培養天數為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長柱狀圖。

1.7 LiCl對DPSCs細胞礦化的影響

1.7.1 礦化形成實驗 配制礦化誘導條件培養基(osteogenic medium，OM)： 含10% FBS的DMEM培養液，加入β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和地塞米松，終濃度分別為10mmol/L、0.05mmol/L和100mmol/L，避光，4℃保存。第3代DPSCs消化后制備細胞懸液，以2×104個/孔的密度接種至24孔板，37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合至80%左右時，將各組樣本孔內的培養液換為對應條件培養基，實驗設置由CCK-8檢測得出的最適宜濃度LiCl實驗組(2.5mmol/L)，礦化誘導對照處理組，含2.5mmol/L LiCl的礦化誘導處理組以及陰性對照組，共4組，每組各設3個復孔；每3d換1次液，分別第14、21天進行茜素紅染色，體式顯微鏡觀察并拍照，比較不同組別礦化效果的差別。

1.7.2 熒光定量PCR檢測 將第3代DPSCs消化后制備細胞懸液，以2×105個/孔的密度接種至6孔板按上述方法礦化誘導培養14、21d后分別使用TRIzol法提取實驗組與對照組DPSCs的總RNA，反轉錄成cDNA，檢測堿性磷酸酶(alkaline phosph-atase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、牙本質基質蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)、牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphorin，DSPP)的表達，以GAPDH為內參，引物序列見表1。PCR反應參數： 95℃ 2min，95℃ 10s，60℃ 10s,72℃ 10s，共45個循環。

1.8 統計學處理

實驗數據由SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

表1 人ALP、BSP、DMP1、DSPP、GAPDH引物序列

2 結 果

2.1 原代人牙髓干細胞的形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察發現，在原代組織貼壁培養后的第5天可見組織塊周圍爬出細胞，呈短梭形，少數呈球形，見圖1A。常規換液培養后，DPSCs生長較快，大多為短梭形，少數為三角形、多角形。對數生長期細胞生長約80%時進行傳代，胰酶消化1min后可見細胞回縮變圓并從瓶壁上脫落，按照1∶3的比例稀釋，傳代培養，傳代后1h開始重新貼壁，細胞形態為長梭形，傳代培養的DPSCs生長很快，細胞呈漩渦樣生長，見圖1B，3～5d可爬滿60mm培養皿的皿底，形成單層細胞。

圖1 體外培養的人牙髓干細胞Fig.1 Human dental pulp stem cells cultured in vitroA： 原代細胞培養第5天；B： 第三代牙髓干細胞傳代培養第2天；標尺： 200μm

2.2 人牙髓干細胞免疫熒光染色結果

免疫熒光染色檢測Vimentin、Cytokeratin 19的表達情況，結果顯示DPSCs表達間充質細胞標志物Vimentin，見圖2A～C，不表達上皮來源細胞表面標志物Cytokeratin，圖2D～F。

圖2 人牙髓干細胞免疫熒光染色結果Fig.2 Immunohistochemistry staining of human DPSCsA～C： Vimentin免疫熒光染色結果；D～F： Cytokeratin免疫熒光染色結果；標尺： 100μm

2.3 流式細胞術鑒定細胞表面標志物

流式細胞術對DPSCs進行細胞表面標志物鑒定，結果顯示，細胞表面標記物CD90、CD105、CD146表達陽性，陽性率分別為98.3%、99.5%和69.9%，見圖3A～C；CD34與CD45則幾乎不表達，圖3D～E。

2.4 LiCl對細胞增殖的作用

通過不同濃度LiCl對人DPSCs增殖影響的比較，發現低濃度(0.1、1mmol/L)LiCl對DPSCs的增殖情況無明顯影響，而在較高濃度(5、10mmol/L)LiCl的作用下，隨著培養時間增長，DPSCs的生長受到明顯抑制。對于本實驗研究，濃度為 2.5mmol/L 的LiCl對DPSCs的增殖有較好促進作用，差異有統計學意義(P<0.05)。因此，本實驗的體外細胞實驗研究中，選用2.5mmol/L作為DPSCs條件培養的最適宜濃度，見圖4。

2.5 LiCl對牙髓干細胞礦化作用的影響

2.5.1 茜素紅染色結果 DPSCs在礦化誘導培養后，可見2.5mmol/L LiCl處理組與對照組相比，礦化結節染色更深；隨著時間推移，培養至21d時，礦化誘導下的2.5mmol/L LiCl處理組深染明顯，見圖5。

2.5.2 熒光定量PCR檢測 DPSCs在誘導培養14d時，在LiCl的作用下，BSP表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而經礦化誘導的作用下，ALP與BSP表達均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。培養后期，與對照組相比，LiCl培養組中BSP表達相對減少，而ALP表達差異無統計學意義。對于成牙本質相關基因DMP1、DSPP，在LiCl以及礦化誘導的作用下，早期表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，當培養至后期，DMP1表達量比對照組減少，而DSPP表達量則無明顯差異，見圖6。

圖4 不同濃度LiCl對DPSCs增殖的影響Fig.4 Effect of different concentration of LiCl on the DPSCs proliferation*P<0.05，**P<0.01

圖5 LiCl對DPSCs礦化作用(茜素紅染色，×40)Fig.5 Effect of LiCl on the mineralization of DPSCs(Alizarin red staining，×40)標尺： 200μm

圖6 熒光定量PCR檢測LiCl對DPSCs礦化作用Fig.6 Effect of LiCl on the mineralization of DPSCs by qPCRA： 14d；B： 21d；*P<0.05

3 討 論

成牙本質細胞是一種特殊的牙髓結締組織細胞，有形成牙本質的作用，是牙髓牙本質復合體的特征性細胞，但它被認為是分裂后細胞或終末細胞，不再有進行有絲分裂的能力。當牙體組織受到損傷而導致牙髓組織暴露時，深層的牙髓干細胞受到淺層細胞凋亡信號的刺激被激活，然后遷移至損傷區域分化形成修復性牙本質來保護牙髓[5-6]。Gronthos等[7]在2000年首次從人第三磨牙牙髓組織中分離培養出牙髓干細胞，并進一步誘導其多向分化，驗證其干細胞特性。Iohara等[8]成功分離培養豬牙髓干細胞后與骨成型蛋白2緩釋微球相結合，植入活髓切斷后的犬牙髓腔內，發現DPSCs向成牙本質細胞分化并促進修復性牙本質的形成。因此，目前對于修復性牙本質形成的研究主要通過誘導DPSCs向成牙本質細胞方向分化來進行。隨著研究的進一步深入，Tran-hung[9]等提出，牙髓損傷的恢復還需要牙髓成纖維細胞的增殖分化、神經纖維的生長以及血管的再生；當牙髓發生損傷時，牙髓干細胞利用牙髓成纖維細胞表達的成纖維細胞生長因子-2和血管內皮生長因子促進形成的新生血管，進一步向成牙本質細胞增殖分化，從而形成修復性牙本質。本實驗通過分離、培養與鑒定人牙髓干細胞，建立牙髓牙本質復合體再生的細胞研究模型，更能模擬臨床中牙髓意外暴露后細胞的增殖與分化過程，為后續的牙髓干細胞生物學行為提供相應的實驗基礎。

Wnt信號通路分為經典Wnt/β-catenin信號通路以及其他非經典通路。Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a等蛋白分子，能有效激活經典Wnt信號通路。Wnt蛋白的受體是卷曲蛋白(frizzled, Fz)，其胞外N端具有富含半胱氨酸的結構域(cystei-nerichdomain, CRD)，能與Wnt結合，其胞內區作用于蓬亂蛋白(dishevelled, Dsh或Dvl)，Dsh與其他蛋白一起阻斷β-catenin的降解途徑，從而使β-catenin在細胞質中積累，并進入細胞核，與T細胞因子/淋巴增強子因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF)相互作用，調節靶基因的表達，此時信號通路被激活[10]。而LiCl作為β-catenin降解蛋白GSK-3β的抑制劑，可以抑制胞質內β-catenin的降解，起到上調經典Wnt通路的作用[11-12]。相關研究[13]表明，一定濃度的LiCl對骨髓間充質干細胞增殖、成骨分化起到促進作用。為此，本課題組猜測LiCl對DPSCs在細胞增殖與細胞分化過程中起到同樣的促進作用。

本研究發現低濃度的LiCl(0.1、1.0mmol/L)對DPSCs細胞增殖無明顯促進作用，而較高濃度(5.0、10.0mmol/L)則明顯抑制細胞增殖。對于本實驗研究結果顯示，2.5mmol/L濃度的LiCl作用于DPSCs具有明顯促進細胞增殖的作用。這與Han等[14]研究結果類似。依據上述結果，本實驗選用2.5mmol/L濃度的LiCl探討其對于細胞成牙/成骨分化的作用，可明顯觀察到礦化結節的形成。作為DPSCs向成牙本質細胞分化的早期標志物的ALP，參與了早期礦化過程[15]，因此ALP的活性升高是牙髓干細胞分化的開始，而BSP則是成骨分化過程中的標志物[16]。作為成牙向分化的標志蛋白，DMP1在體內參與調節牙體生長發育、形態發生以及部分骨組織的形成[17]；DSPP在牙本質形成過程中起到重要的調節作用[18]。因此，上述基因的升高均為干細胞成牙/成骨分化的標志。為了證明LiCl在誘導礦化并伴隨有成牙本質/成骨基因表達的增加，本研究通過實時定量PCR檢測ALP、BSP、DSPP及DMP1的mRNA表達，結果顯示LiCl對上述成牙/成骨基因表達均有一定的促進作用，證明了LiCl對DPSCs具有促進礦化的作用。然而，當培養至21d 時，所有基因與對照組相比，較14d表達均有所下調，是由于此時的礦化誘導培養組的細胞已完全長滿于孔內，對照組仍有生長的空間，能夠緩慢表達相關基因。因此實驗組相關基因表達趨勢相對減緩可能是培養環境與條件受限有關。

綜上所述，本研究認為適宜濃度的LiCl對牙髓干細胞具有良好的促進增殖、成牙/成骨向分化的作用，這可能與其通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調相關基因表達的結果有關，相關機制仍須深入探討，而對于Lid能否作為有效的蓋髓材料則需動物蓋髓實驗作進一步研究。