TMEFF2基因對人胚腎細胞生物學行為的影響

常換換，李 姣，賈 松，許 潔，呂立夏，徐 磊

(同濟大學醫學院再生醫學系生物化學與分子生物學教研室，上海 200092)

TMEFF2(transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains)基因是一種編碼含有兩個類卵泡抑制素區域和一個類表皮生長因子區域的Ⅰ型跨膜蛋白，已報道的TMEFF2是來自海馬和中腦區域神經元的新型存活因子，并選擇性表達于成人大腦和前列腺。近年來，許多體外和體內模型的研究[1-3]報道了TMEFF2的腫瘤抑制作用。TMEFF2在腫瘤組織中的表達明顯低于正常組織且與腫瘤的發生發展相關，能減弱癌細胞的遷移[4-5]，在抑制細胞增殖的過程中也觀察到了TMEFF2基因表達的上調。Han等[6]發現，TMEFF2的腫瘤抑制作用是通過JAK-STAT-干擾素信號傳導途徑介導。然而亦有相反的研究報道[7]認為TMEFF2可發揮癌基因的作用，在腫瘤組織中的表達高于正常組織，其胞外區可引起ERK1/2的磷酸化，進而促進前列腺癌細胞生長[8]。由此可見，前期有關TMEFF2與細胞增殖的研究結果存在諸多不一致，其生物學功能還有待進一步闡明。本研究采用RNA干擾技術降低TMEFF2基因在HEK293細胞中的表達，并利用RNA-seq技術篩選差異表達基因，采用GO和KEGG富集分析對差異基因進行生物信息學分析；探索TMEFF2基因對HEK293細胞增殖、細胞周期、凋亡、遷移等生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HEK293細胞為同濟大學醫學院徐磊課題組存留，干擾載體H1-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin(shRNA-TMEFF2)由上海吉凱基因科技有限公司合成；胰酶、青鏈霉素購自美國ThermoFisher公司；DMEM培養基、胎牛血清購自美國HyClone公司；轉染用培養基；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，引物合成、DEPC水購自上海生工生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒、1×蛋白上樣緩沖液購自中國碧云天生物技術公司；大劑量質粒提取試劑盒、SYBR Green Ⅰ、熒光定量RT-PCR試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒購自中國天根生化科技有限公司；TMEFF2一抗、二抗，GAPDH一抗、二抗，ECL化學發光檢測用試劑盒購自美國ProteinTech公司；氯仿、異丙醇、甲醇、乙醇購自中國國藥集團化學試劑有限公司。流式細胞儀(FACS Verse)購自美國BD公司；熒光定量PCR儀(Step One Plus)購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 復蘇HEK293細胞將其轉入6孔板中,在37℃、5%CO2細胞培養箱中培養過夜。每1～2d傳代1次；待細胞生長密度達50%以上時進行轉染，2組分別進行以下處理： shRNA-TMEFF2組加入4μg質粒DNA、10μL質體轉染劑Lip LipofectamineTM2000；NC-TMEFF2組加入4μg質粒DNA、10μL脂質LipofectamineTM2000作為對照，培養5h后再更換正常培養基繼續培養24h，置于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達。

1.2.2 實時熒光定量PCR 分別提取轉染后生長狀態良好的實驗組、對照組細胞的總RNA。按照反轉錄試劑盒操作說明將總RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行熒光定量PCR，引物序列如下。TMEFF2基因上游引物： 5′-TTTGCCAGTTT-GGTGCAGA-3′，下游引物： 5′-GATTGAAGTTGG-TTTGAGAACAGTCA-3′；GAPDH上游引物： 5′-CGGGAAGCTTGTGATCAATGG-3′，下游引物： 5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG-3′。反應條件如下： 95℃ 15min預變性，95℃ 10s，60℃ 30s共40個循環。以GAPDH的CT值作為參考基準，用2-ΔΔCt法計算mRNA的倍數變化。

1.2.3 蛋白質電泳 收集轉染后生長狀態良好的2組細胞，用蛋白抽提試劑盒提取實驗組、對照組細胞的蛋白并進行定量計算，取30μL總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后以5%脫脂牛奶封閉1.5h，一抗(1∶300)4℃孵育過夜，二抗(1∶500)常溫孵育2h，TBST洗膜3次，每次5min，曝光，以內參GAPDH為基準比較目的蛋白的表達量。使用Image J軟件進行定量分析。

1.2.4 增殖實驗 將HEK293細胞按每孔100μL(2.0×104個/mL)加入96孔板中培養，待細胞貼壁后進行轉染。轉染后0h、24h、48h、72h用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況。每次時間節點按照每孔加10μL CCK-8溶液于96孔板中，后放于培養箱中培養2h，用BIO-RAO酶標儀在450nm處測量吸光度(A450)值,連續測3d。

1.2.5 細胞周期實驗 取轉染后生長狀態良好的細胞，用胰酶消化后收集細胞培養液到離心管內備用。1000×g離心5min，棄上清液，留細胞沉淀。加入1mL預冷的PBS，重懸細胞。再次離心沉淀細胞，棄上清液,分散細胞;加入1mL預冷的70%乙醇，吹打混勻，4℃固定12h。1000×g離心5min,棄上清液。PBS洗1遍，重懸細胞。再次離心沉淀細胞，棄上清液；每管細胞中加入0.5mL 碘化丙啶(PI)染色液，重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴30min，過濾細胞，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6 細胞凋亡實驗 取轉染后生長狀態良好的細胞，胰酶消化加入細胞培養液，1000×g離心5min，棄上清液，收集細胞，PBS重懸細胞并計數；取5×104重懸的細胞，1000×g離心5min，棄上清液，加入195μL AnnexinV-FITC結合液重懸細胞，加入5μL AnnexinV-FITC，混勻，加入10μL PI染色液，混勻，室溫避光孵育15min，隨后冰浴，過濾細胞進行流式細胞儀檢測。

1.2.7 侵襲實驗 配制基質膠，加入到Transwell小室的上室，37℃細胞培養箱中干燥。在Transwell下室中加入500μL含10%FBS的培養基(趨化劑)，將各組細胞用無血清培養基混勻后分別取200μL 加入上室中，置于培養箱中培養48h，用棉簽擦去上室未穿過的細胞。由于本實驗細胞表達綠色熒光蛋白，即48h后直接將下室置于顯微鏡下觀察綠色熒光，每個樣本隨機選取3個視野，計數每個視野染色細胞的數量，取平均值即穿膜細胞數。

1.2.8 劃痕實驗 將細胞接種于6孔板，恒溫細胞培養箱中培養，轉染后備用。用10μL無菌槍頭在6孔板底部，輕劃一條力度和角度一致、粗細均勻的直線，分別于0、48h在顯微鏡下觀察同一視野劃痕的寬度并拍照。

1.2.9 轉錄組測序 抽提RNA樣本，用Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性、用NanoPh-otometer spectrophotometer檢測RNA 純度、用Qubit 2.0 Fluorometer測RNA濃度；取1μg總RNA進行建庫。建庫NEBNext?ΜLtraTMRNA Library Prep Kit。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling，之后進行Illumina測序,并產生150bp配對末端讀數。隨后進行數據指控、序列比對到參考基因組、新轉錄本預測、基因表達水平定量、差異表達分析、差異基因富集分析(GO分析、KEGG分析)。

1.2.10 qPCR驗證轉錄組測序 選取8個基因SIPA1L3、ADGRL1、RGCC、SPDYE2、CEACAM19、NECTIN4、BTG3和SDK2進行qPCR驗證，采用2-ΔΔCt的方法進行相對定量，計算表達差異的倍數，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.11 Western印跡法驗證轉錄組測序 針對轉錄組測序結果中差異變化較大的3個基因ADGRL1、NECTIN4、RGCC進行蛋白水平驗證，分析在TMEFF2基因低表達后這些基因的變化情況，進一步探究TMEFF2基因的功能。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 熒光顯微鏡觀察、qPCR、Western印跡法檢測目的基因TMEFF2在HEK293細胞中的表達

熒光顯微鏡下觀察到GFP在HEK293細胞中表達，表明外源性TMEFF2基因成功轉染進入HEK293細胞，見圖1；qPCR顯示實驗組mRNA較對照組明顯降低，見圖2；Western印跡法檢測到實驗組在HEK293細胞中的表達量明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖3，結合以上結果，表明TMEFF2基因低表達模型建立成功。

圖1 GFP在HEK293細胞中的表達Fig.1 Expression of GFP in HEK293 cellsA： 對照組;B： shRNA-TMEFF2組；標尺： 400μm

2.2 TMEFF2基因低表達抑制HEK293的增殖，且細胞阻滯在G1期

轉染TMEFF2基因0h,2組之間細胞相對吸光值差異無統計學意義(P>0.05)；轉染24、48、72h 后，shRNA-TMEFF2細胞相對吸光值均明顯低于NC-TMEFF2組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明TMEFF2基因低表達抑制了HEK293細胞的增殖，見圖4。

流式細胞儀檢測細胞周期，顯示shRNA-TMEFF2組較NC-TMEFF2組處于G1期的細胞明顯增多，S期的細胞明顯降低，細胞呈G1期阻滯，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

2.3 細胞凋亡實驗

用流式細胞儀收1.0×104個細胞，shRNA-TMEFF2組較NC-TMEFF2組Q3區間均出現早期凋亡細胞(即Annexin V-FITC染色陽性的細胞),差異具有統計學意義(P<0.05)，說明TMEFF2基因低表達后可能影響HEK293細胞的凋亡，見圖6。

圖2 qPCR檢測HEK293細胞中TMEFF2的表達Fig.2 qPCR detection of TMEFF2 expression in HEK293 cellsA： mRNA相對表達量；B： 熔解曲線；C：擴增曲線，與NC-TMEFF2組相比，**P<0.01

圖3 Western印跡法檢測HEK293細胞中TMEFF2的表達Fig.3 The expression of TMEFF2 in HEK293 cells identified by Western blotting

圖4 HEK293細胞增殖實驗Fig.4 The proliferation assay of HEK293 cell與NC-TMEFF2組相比,*P<0.05

圖5 2組HEK293細胞周期的變化情況Fig.5 Cell cycle changes in 2 groups of HEK293A： NC-TMEFF2組;B： shRNA-TMEFF2組;C： G1期、S期、G2期占比統計

2.4 細胞侵襲、遷移實驗結果

與對照組相比實驗組細胞處理48h后，穿過基膜的細胞數降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明TMEFF2基因低表達后抑制了HEK293細胞的侵襲能力，見圖7。

圖6 HEK293細胞凋亡實驗Fig.6 HEK293 cell apoptosis experimentA： NC-TMEFF2組;B： shRNA-TMEFF2組;C： 凋亡率統計圖表；與NC-TMEFF2組相比，*P<0.05

圖7 Transwell法檢測2組HEK293細胞侵襲能力Fig.7 Transwell method to detect the invasive ability of 2 groups of HEK293 cellsA： NC-TMEFF2組，B： shRNA-TMEFF2組；C： 2組細胞侵襲數量統計圖；與NC-TMEFF2組相比，*P<0.05；標尺=400μm

劃痕實驗顯示，HEK293細胞在處理48h后，對照組和實驗組寬度均變窄；與對照組相比，實驗組細胞劃痕愈合能力明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明TMEFF2基因低表達后抑制了HEK293細胞的遷移能力，見圖8。

圖8 2組HEK293細胞的劃痕實驗結果Fig.8 Scratch test results of 2 groups of HEK293 cellsA： 劃痕實驗結果；B： 2組細胞劃痕相對寬度統計;與NC-TMEFF2組相比，*P<0.05；標尺=1000μm

2.5 RNA-seq結果

本實驗2組樣品各有3個平行組，其中樣本間相關性差異R2>0.977,對2組樣品測序原始數據去除低值序列后，對照組和實驗組過濾后的序列數分別為43和45，Q30分別為91.72%和89.95%。與對照組相比，實驗組共有4769個基因表達差異有統計學意義，其中2355個基因上調，占49.4%，2414 個基因下調，占50.6%。對2組樣品差異基因進行GO分析，分為生物過程、細胞組成和分子功能3類。在生物過程中，主要參與靶向蛋白質定位，其次為mRNA的分解代謝過程；在細胞組成中，主要為參與胞內細胞器形成的調控，在分子功能中，主要為表現為蛋白結合功能，其次是催化活性。通過對KEGG通路的分析，結果顯示與細胞增殖、細胞周期及細胞黏附的基因發生顯著變化，分別有8個、21個、13個發生顯著變化，見圖9。

2.6 qPCR驗證結果

通過qPCR方法對8個差異表達基因(SIPA1L3、RGCC、CEACAM19、SPDYE2、NECTIN4、BTG3、SDK2、ADGRL1)進行驗證，得到shRNA-TMEFF2組與NC-TMEFF2組基因表達量的比值，結果顯示SPDYE2、SDK2、CEACAM19、ADGRL1和SIPA1L3表達均上調，RGCC、BTG3、NECTIN4表達均下調，與RNA-seq的測序結果相比較，8個基因的表達量趨勢一致，證明了RNA-seq的結果是正確的，見圖10。

圖9 與細胞增殖、細胞周期及黏附有關的差異表達基因Fig.9 The different expression of genes associated with proliferation, cell cycle and adhesion

圖10 通過qPCR方法驗證RNA-seqFig.10 Validation of RNA-seq by qPCR與NC-TMEFF2組相比,*P<0.05

2.7 Western免疫印記法驗證轉錄組測序

培養HEK293細胞，轉染低表達載體及其對照組的質粒DNA，抽提蛋白后做電泳實驗。實驗組3個蛋白的變化情況如下： 與NC-TMEFF2組相比，shRNA-TMEFF2組RGCC、NECTIN4蛋白表達水平顯著下降，ADGRL1蛋白表達水平明顯升高,3組差異均具有統計學意義(P<0.05)，結果表明蛋白水平的變化同轉錄組測序的結果趨勢相同，進一步驗證了其正確性，見圖11。

圖11 Western印跡法驗證RNA-seq結果Fig.11 Results of validation of RNA-seq by Western blotting

3 討 論

TMEFF2編碼的是含有EGF(epidermal growth factor, EGF)樣序列和兩個卵泡抑制素結構域的跨膜蛋白，它在胚胎中有選擇地表達在成人大腦和前列腺中早期的文獻主要關注TMEFF2基因對腫瘤細胞生長的作用，既有腫瘤抑制作用也有促進作用，這說明TMEFF2基因在腫瘤中作用的發揮依賴一定的環境和條件，其中在原發性、轉移性前列腺癌[9]和部分平滑肌瘤中表達上調，而在膠質瘤和胃癌[10]中表達下調。近年來，隨著高通量測序等研究手段的進步，TMEFF2在許多實體腫瘤中作用的分子機制研究逐漸增多，比如TMEFF2基因在結直腸[11]、甲狀腺惡性組織[12]、子宮內膜癌[13]、腎細胞癌[14]等多種腫瘤細胞中均可見TMEFF2的啟動子呈甲基化[15]狀態。

本實驗發現，干擾TMEFF2基因表達后，人胚腎細胞HEK293的增殖受到明顯的抑制。進一步通過流式細胞儀檢測，發現TMEFF2基因低表達后，細胞主要阻滯在G1期。在細胞周期中，G1期即DNA合成前期，此期主要合成RNA和核糖體，該期物質代謝活躍，主要意義在于為下階段S期的DNA復制作好物質和能量的準備。轉錄組測序顯示： 細胞周期調節基因(regulator of cell cycle, RGCC)表達顯著下降，研究[16]表明通過其與細胞周期蛋白依賴性激酶1的相互作用參與驅動G1/S和G2/M期轉變，TMEFF2基因低表達后可能阻斷了G1期向S的轉變，導致細胞生長阻滯在G1期即抑制細胞生長；TMEFF2基因低表達后，信號誘導增殖相關蛋白1樣蛋白3抗體(signal-induced proliferation-associated 1 like protein 3, SIPA1L3)基因表達量上升。研究[17]發現，SIPA1L3基因編碼GTP酶活化蛋白，而IQGAPl表達上調可能通過激活ERKl/2信號通路參與誘導腎細胞凋亡的病理過程。推測TMEFF2基因低表達后可能通過影響SIPA1L3基因進一步影響GAP來誘導細胞凋亡；TMEFF2基因低表達后，ADGRL1(Latrophilin adhesion-GPCRs)表達量上升，研究[18]表明，ADGRL1與FLRT1-3(Fib-ronectin leucine-rich repeat transmembrane protein-3)相互作用，從而促進細胞黏附，推測TMEFF2基因低表達后，可能通過該途徑抑制細胞遷移。本研究只是初步了解了TMEFF2基因低表達后對于HEK293細胞的生物學行為的影響，具體作用的機制待進一步研究。