糖尿病血管并發癥微小RNA研究進展

范澤楠，賀朝暉綜述，方 丹,3審校

（西南醫科大學：1臨床醫學系2015級；2藥物研究中心；3心血管藥理系，四川瀘州 646000）

糖尿病主要包括1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、妊娠期糖尿病及其他特殊類型。其中，尤以1型和2型DM對人體血管系統產生的影響較大，從而導致嚴重微血管并發癥，例如糖尿病視網膜病變(影響著1/3糖尿病患者)、腎臟相關疾病(糖尿病患者終末期腎病的患病率較非糖尿病患者高出10倍)和神經病變(全球每30 s有1個糖尿病患者因此截肢)；以及導致糖尿病大血管并發癥如冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、高血壓和中風等[1-3]。此外，糖尿病腎病等微血管并發癥與心血管疾病的加速發展有著密切的關系。最新研究數據揭示，2017年用于糖尿病的醫療總支出達7270億美元，全球已有4.25億糖尿病患者；目前，中國有1.14億糖尿病患者，位列全球首位，該數目在2045年預計會增至1.19億[1]。我國的糖尿病現狀嚴峻至此，可見其防治至關重要。

研究表明，糖尿病患者血管并發癥發病率的增加與多種病理因素（如高血糖、高脂血癥、晚期糖基化終末產物、生長因子、炎性細胞因子和趨化因子等）關系密切[4-5]。如果大多數糖尿病患者的血管并發癥不能盡早被給予治療，其生活質量的提高將無從談起，甚至其生命也會受到相當威脅。此外，“代謝記憶”現象也逐漸引起臨床研究關注，即在治療過程中，部分糖尿病患者盡管血糖得到了有效控制，但血管并發癥的發展卻仍在繼續[6]。因此，為了尋求更佳的治療方法，更深入探尋在糖尿病病理狀況下血管并發癥加速發展的分子調控機制及作用機理的重要性不必贅述。本文對糖尿病微血管并發癥病理過程中的miRNA研究進展作出綜述，揭示其在基因表達調控網絡及對靶基因的精細調控機制中扮演的角色，展望其作為糖尿病微血管并發癥的臨床診斷和治療新靶點的廣闊臨床研究前景。

1 微小RNA簡介

微小RNAs(micro RNAs,miRNAs)是由約20～22個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，在生物體內參與調節著眾多關鍵的細胞生物學功能，扮演著重要角色[7]。20世紀90年代初，研究者首次在秀麗隱桿線蟲中發現了第一個miRNA，命名為miRNA-Lin-4[8]。據估計[9]，目前已經發現的人類miRNA超過1000種，它們參與調控了約60%的人類蛋白編碼基因，影響靶蛋白功能。miRNA的生物學合成主要涉及在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，細胞核基因組中miRNA基因轉錄合成初級RNA（pri-miRNA），在Drosha-DGCR8復合體的切割效應下，初級miRNA在核內形成約70 nt且具備莖環構造的前體miRNA，隨即在RanGTP/Exprotin-5復合物的介導下由核入胞，被Dicer酶切割為雙鏈miRNA（miRNA★復合體）后又在RNA解旋酶的作用下分離，在AGO蛋白和RNA解旋酶的幫助下，成熟的miRNA單鏈以不對稱的方式組裝成RNA誘導的緘默復合物（RISC）中，并通過與目標基因的3'-UTR區堿基互補配對來引導RISC復合物抑制目標mRNA翻譯，動物miRNA與目的mRNA堿基配對水平相對較低，其中多數是為了抑制翻譯[10-12]。

研究表明，在許多疾病生理、病理調節過程中都有miRNA的身影，一些miRNA在糖尿病及血管相關并發癥發生發展過程中扮演著重要調控角色，然而其具體分子調控機制遠未研究清楚。因此，明確miRNA與糖尿病血管并發癥相關靶標的作用及分子機制顯得尤其必要，這將為確定新型糖尿病血管并發癥生物標志物及治療靶點提供一定的理論基礎及實踐依據[13-14]。

2miRNA與糖尿病血管并發癥

2.1 糖尿病性視網膜病變miRNA研究進展

糖尿病視網膜病變（DR），糖尿病常見微血管并發癥之一，是患者致盲的可能原因[15]。部分研究已經揭示了miRNA在糖尿病視網膜病變過程中所發揮的重要調節作用。例如，Ye等[16]報道，miR-1273g-3p在鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠的視網膜色素上皮細胞（RPE）中高度表達，推測其是通過調控自噬溶酶體通路參與DR的進展，該研究初步揭示了DR治療的新靶點。Zhao等[17]研究發現，在高糖（HG）處理的人RPE細胞中，miR-219-5p水平顯著上調，并且肝臟受體同源物1(LRH-1)是其直接靶標，HG處理后，靶標LRH-1表達呈顯著下調趨勢，進一步研究揭示miR-219-5p抑制劑可顯著抑制HG誘導的ARPE-19細胞凋亡，提高細胞存活率，并且LRH-1/Wnt/β-Catenin信號通路受到miR-219-5p抑制作用，但LRH 1抑制可消除miR-219-5p抑制劑對ARPE-19細胞的影響，綜合提示miR-219-5p能夠通過調節LRH-1/Wnt/β-Catenin信號通路進而調控人RPE細胞凋亡，參與DR的發生發展。Zhang等[18]研究發現miR-495在HG處理的視網膜神經節細胞（RGCs）中表達顯著上調，抑制miR-495表達可減少RGCs的凋亡。值得注意的是，miR-495對Notch1表達和Notch信號通路存在負性調控，而miR-495表達下調將可進一步抑制PTEN表達，促進Akt活化，敲除Notch1基因后，下調miR-495帶來的保護作用被抑制。故而研究者認為，下調miR-495可以通過靶向Notch1調控PTEN/Akt信號，從而減輕HG誘導的RGCs凋亡，這為理解HG誘導的RGCs凋亡的發病機制提供了新的見解。

2.2 糖尿病腎病miRNA研究進展

研究表明，miRNA可作為糖尿病腎病(DN)的治療標志物及治療標靶，腎小球系膜區和足細胞等處細胞外基質(ECM)蛋白的堆積是DN的主要特征[19]。Chen等[20]研究發現，DN患者血清和腎組織、STZ誘導的DN大鼠腎組織和HG處理的足細胞中.miR-21表達上調，miR-21缺失可抑制STZ誘導的DN大鼠促炎因子（IL-1β、TNF-α）分泌，減輕腎臟損傷。TIMP3過表達可抑制HG誘導的炎癥反應和足細胞凋亡。此外，TIMP3的上述抑制作用隨著miR-21的增加而減輕。miR-21通過靶向TIMP3抑制STZ誘導的DN大鼠和HG處理的足細胞的DN進程，這可能提供了DN治療新的靶點。Zanchi等[21]研究發現，DN大鼠模型中miR-184水平相較于對照組顯著升高，而脂質磷酸酶3（LPP3）水平下降。其抑制劑可明顯改善大鼠腎小管間質纖維化及LPP3水平，認為miR-184可能通過LPP3作為下游效應因子，促進腎小管間質纖維化。Gholaminejad等[22]通過meta分析得出5個與DN顯著相關且持續失調的miRNA，其中包括三種上調miRNA(miR-21-5p，miR-146a-5p,miR-10a-5p)和兩種下調miRNA(miR-25-3p和miR-26a-5p)，未來的研究應集中于發現它們對DN的潛在作用及其作為DN生物標志物和治療介質的臨床價值。近期，Jia等[23]研究認為，含有miRNA的細胞外囊泡(EVs)是一種新型的細胞通訊方式，可能與DN期間腎臟纖維化不可避免的擴大有關，腸促胰島素類似物（Exendin-4）抑制EV miR-192從HG誘導的腎小管上皮細胞向正常細胞的轉移，從而抑制胰升糖素樣肽-1受體基因（GLP1R）下調，保護腎細胞。

2.3 糖尿病下肢缺血miRNA研究進展

肢體缺血和血管內皮功能障礙是糖尿病的另一個并發癥。Caporali等[24]發現在HG培養和缺血相關細胞饑餓條件下，內皮細胞中miR-503表達水平上調。阻斷miR-503，內皮細胞的體外功能可以得到提高。他們驗證了CCNE1和cdc25a是miR-503的直接目標，在HG的作用下，miR-503的水平有一定下調。在STZ糖尿病小鼠的缺血肢體肌肉中，其表達水平也有所上調。此外，將一種基于miR-503誘餌的腺病毒遞送到糖尿病小鼠的缺血肌肉中，可以糾正這些小鼠缺血后血管生成的損傷。值得注意的是，在人類糖尿病患者獲得的肌肉樣本中，miR-503水平的水平與cdc25蛋白水平呈負相關，這提示miR-503可能是糖尿病并發肢體嚴重缺血患者的潛在希望。糖尿病周圍動脈疾病(PAD)患者缺血后新生血管受損，Chen等[25]研究發現，在培養的糖尿病小鼠內皮細胞中，miR-133a的拮抗作用導致活性氧水平降低，一氧化氮和cGMP水平升高，新生血管增多，而miR-133a過表達會損害血管生成，降低非糖尿病模型的GCH1、NO和cGMP水平，認為糖尿病誘導的miR-133a上調是通過減少內皮細胞NO合成而抑制PAD中的血管新生。

2.4 糖尿病性心臟病miRNA研究進展

研究表明[26]，導致血管細胞多種炎癥及纖維化途徑的異常信號多由高血糖激活，而這將導致心血管并發癥（包括冠心病、中風、高血壓和動脈粥樣硬化）的增加。此外，糖尿病性心肌病作為糖尿病的并發癥之一，與心力衰竭關系密切。

Fomison等[27]對從糖尿病心臟分離的高糖和心臟祖細胞(CPCs)培養的成人心肌細胞的分析證實，促凋亡caspase-3/7活性顯著增加可能與miR-34a顯著上調和SIRT1下調有關。雖然治療性抑制miR-34a活性可以恢復心肌細胞和CPCs中SIRT1的表達，但p53表達在心肌細胞中進一步上調，而在CPCs中則相反下調。miR-34a抑制在p53增加的情況下仍能顯著降低高糖誘導的心肌細胞凋亡，但這種效應在CPCs中沒有被觀察到，其可能與miR-34a受到抑制后CPCs的增殖減少有關。因抑制miR-34a活性的作用隨細胞類型不同而不同，故在引入其治療時需要消除非靶向效應。AMP脫氨酶(AMPD)在腺嘌呤核苷酸代謝中起著至關重要的作用,Tatekoshi等[28]研究發現，在2型糖尿病OLETF模型大鼠心臟壓力超載條件下，ATP消耗和收縮功能障礙與AMPD活性上調有關，OLETF和LETO心肌中AMPD3的mRNA水平相似、泛素化程度相當，與LETO相比，OLETF中57個miRNA下調，其中miR-301b與AMPD3 mRNA的3'UTR相互作用。在H9c2細胞中，miR-301b抑制劑及模擬物能分別顯著提高和降低AMPD3蛋白水平，miR-301b-AMPD3軸可能是干預糖尿病心臟內能量代謝的一種新的治療靶點。

3 糖尿病血管并發癥miRNA與遺傳學及表觀遺傳學之間的關聯

DN等并發癥似與遺傳易感性有關，包括特定臨床隊列中的全基因組相關研究(GWAS)在內的許多嘗試已經促成了一些候選基因和序列變異的識別[29]。然而，此類基因和變異體的功能及病理作用的界定還尚未明確，因此遺傳易感性的具體參與似乎更復雜而或更小。研究[30]表明，表觀遺傳學對此也十分重要，因此，具有表觀作用機制的miRNA也應被考慮進來。值得一提的是，包括miRNA、表觀遺傳學和遺傳學在內的多種因素之間可能存在新的相互作用機制。正如前述，染色質中具有表觀遺傳功能的基因可能是直接靶向和下調的miRNA，染色質的重塑和基因表達可能受到影響。在糖尿病小鼠的VSMC中，miR-125 b相對于對照組上調，并且也有可能靶向染色質組蛋白h3k9甲基轉移酶suv39h1，增加糖尿病細胞炎癥基因的表達[31]。Sun等[32]報道，在T2DM患者血漿中，miR-375存在過表達，且其啟動子低甲基化，這可能參與miR-375的表達調控，并參與T2DM的發病機制。因此，通過下調關鍵細胞抑制因子，miRNA可以作為促進染色質的表觀遺傳去抑制機制，導致與糖尿病并發癥的病理相關的基因的誘導。

盡管有報告稱有一些單核苷酸多態性(SNPs)與各種疾病的相關，但它們很少與疾病發病率直接相關。此外，迄今為止，大多數遺傳研究已經評估了基因編碼區的SNPs。另一方面，Ning等[33]研究表明，SNPs可能在非編碼區域發揮重要作用，包括在啟動子、增強子和miRNA種子區域。由于miRNA可以通過目標基因的3'非翻譯區來影響基因表達，如果在miRNA處理位點周圍或成熟的miRNA種子序列存在任何序列變異，miRNA的生物合成及其功能和目標基因將會發生巨大變化，它可能會通過改變組織和細胞基因表達譜從而影響疾病的易感性。因此，miRNA種子序列的SNPs和變異值得被關注，因為它可能給我們帶來更多的驚喜。

除了遺傳易感性之外，其他因素，特別是環境和表觀遺傳學，可能提供“染色質二次打擊”，存在將有關于疾病的SNPs轉化為導致疾病SNPs的功能。Miao等[34]的研究中，將1型糖尿病患者的血液單核細胞的組蛋白修飾情況與正常志愿者做出一定的比較，發現兩個MHC位點基因dr B1和dq B1的增強子區域的組蛋白乙酰化水平存在顯著差異，這與1型糖尿病高度相關。Sapienza等[35]研究比較了糖尿病患者和非糖尿病腎病患者唾液樣本中的DNA甲基化。一些差異甲基化候選基因曾被報道過與腎臟疾病相關。目前正在進行一些努力，以評估存檔的基因組DNA中的表觀遺傳變化(如DNA甲基化)，以及各種并發癥的糖尿病患者的大型臨床組群的組織和血液細胞RNA中的miRNA分布情況。大多數情況下，因這些患者的遺傳數據已能被獲得，故而在整個測序過程、實驗證明以及由先進的基因組學、轉錄組學、外遺傳基因組學和計算方法輔助的電子/系統生物學方法的數據集上的數據集的整合，無疑將會產生重要的新信息。這些新的方法將極大提高對未知領域的探索，加速發現臨床急需的治療糖尿病并發癥的新療法。

4 miRNA作為糖尿病血管并發癥新型生物標記物

近年來，細胞、組織和體液中的miRNA檢測技術得到了一定發展，包括敏感的定量PCR、微陣列以及高通量的深度測序。因此，開發miRNA作為人類疾病和組織損傷的敏感生物標志物潛力巨大。由于miRNA是相對穩定和容易量化的，并且是以血漿和尿液的非侵入方式，這可能滿足了對糖尿病并發癥的早期檢測的生物標記的關鍵需求，能夠可以極大地促進長期的臨床管理。報道[36-38]表明，血液中循環的miRNA可以是癌癥、組織損傷等敏感的生物標志物。Fomison等[27]研究發現，相較于非糖尿病對照組，miR-34a水平在無癥狀2型糖尿病患者早期循環中顯著升高，且其同時在2型糖尿病患者心臟中顯著上調，這極有可能與心肌細胞的凋亡相關，從而作為糖尿病心臟病的基礎，故而miR-34a作為糖尿病心臟病的早期診斷的價值值得探索。Alkafaji等[39]報道，在微白蛋白尿和大白蛋白尿的DN患者中，血液miR-377水平與患者腎功能呈負相關，而與白蛋白尿的嚴重程度存在一定的正相關，而血液miR-192水平與白蛋白尿嚴重程度呈負相關，與腎功能呈正相關，基于血液的miR-377和miR-192可能作為早期檢測DN的潛在生物標志物。DN患者尿液中miRNA譜也發生改變[40]。Mazzeo等[41]通過研究發現，miR-150-5p、miR-21-3p和 miR-30b-5p可能是糖尿病視網膜病變發病的潛在生物標志物。

這些miRNA作為檢測相關糖尿病并發癥的早期階段的生物標志物的價值不可限量。與腎、血管和血細胞相關的miRNA可以在血清和尿液樣本中被檢測，這得益于各種運輸機制。當然，應當注意到循環miRNA并不總是與組織水平相關。然而，體液中循環miRNA的評價作為糖尿病并發癥的診斷生物標志物的未來仍然可期。

5 展 望

預防或延緩并發癥的進展是糖尿病臨床管理的主要目標，miRNA靶向與常規藥物結合治療可能是當前臨床診治的一個新途徑。miRNA整個信號通路因為其復雜但精密的調節機制而在多種病理過程中都有希望成為很有效的治療藥物(miRNA類似物)或治療靶點(antimiRs)。同時，RNA分子輸送技術的日益提升使得基于miRNA的疾病治療方案的現實性也隨之攀升。

近年來，RNAi基因治療技術日新月異，這使臨床有可能使用RNA分子遞送特定的miRNA基因藥物來治療糖尿病及其血管并發癥，深入了解糖尿病血管并發癥病理過程分子機制可以為相關miRNA藥物研發打下基礎。此外，miRNA相關藥物的研發也離不開對糖尿病患者樣本深入且系統的分析，并通過體內和體外模型闡明了目標miRNA與糖尿病血管并發癥之間的生物學關系和發病機制。目前，可供檢索的公共數據庫繁多，可以查詢不同糖尿病患者正常組織與血管病變組織的基因組學及蛋白質組學的相關數據。通過數據庫分析與分子實驗驗證相結合，可以鑒定出一些臨床上有希望的miRNA候選。下一個主要挑戰包括對體內使用的miRNA類似物及抗miRS進行化學修飾以增加其穩定性，以及藥物遞送系統的選擇和優化。

2018年8月，美國食品和藥物管理局批準了首款用于治療成人遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉變性的小干擾RNA藥物。Alnylam公司的產品patisiran（商品名Onpattro）RNA獲FDA批準上市，這成為小干擾RNA藥物發展的里程碑，它標志著RNA干擾技術在臨床治療中的驗證。本研究相信，小核酸藥物黃金時代已經到來，有關專家預測，2025年全球市場規模將遠遠超過100億美元。近年來，RNAi藥物的研發遭遇瓶頸，副作用便是其最大的障礙。然而，隨著目前RNAi技術的進步、藥物遞送系統的突破、新產品的獲批，RNAi藥物將最終迎來曙光。

6 結論

RNAi藥物將在未來迎來快速發展，這將是一個迅猛前進的領域。目前，一些miRNA基因藥物的臨床試驗獲得迅猛發展，這從另一個方向揭示了靶向miRNA的治療是未來的希望。隨著更多地了解miRNA在體外和體內精細具體負責的分子調控機制，研究將能夠更好地利用它們作為非侵入性生物標記物，乃至研發更好的基于miRNA基因治療糖尿病及其血管并發癥的體內遞送方法。