封閉血管內皮生長因子C對角膜淋巴管的抑制和對同種移植物存活的促進作用研究△

方廷兵 嚴 浩 徐志蓉 馮 梅 王增智

(廣東省深圳市南山區人民醫院眼科 深圳 518052)

角膜移植是現在比較成熟的技術，通過角膜移植拯救了大量的失明患者，但是現在研究發現角膜移植5年后有復發的情況。通過調查發現，我國因為角膜失明的患者有250萬人左右，成為我國第二致盲的原因，角膜移植現在成為唯一使失明患者治愈的治療手段。正常的角膜沒有淋巴管和毛細血管，如果因為某些原因可能會使角膜發生損傷，在修復的過程中，一些炎癥因子的參與導致角膜可能發生新生毛細血管和淋巴管的增生，造成患者的失明[1]。近些年有研究證實角膜新生血管和淋巴管均加速高危移植后的免疫排斥反應[2]，相比新生血管，角膜新生淋巴管起著更重要的作用[3]。現在發現血管內皮生長因子C 可以促進淋巴管的增生[4]，增加角膜移植后的復發機率。本實驗主要研究抑制血管內皮生長因子C對淋巴管的作用以及對移植角膜后角膜存活率的研究。

1 實驗材料

1.1 實驗器材和試劑

裂隙燈(泗洪縣愛爾醫療器械廠)；RT-PCR檢測儀(吉滿生物科技有限公司)；熒光倒置相差顯微鏡(上海儀天科學儀器有限公司)；抗VEGF-C單克隆抗體(上海昕浩生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物和實驗分組

100只BALB/c雄性小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，隨機分為3組，每組20只，其余40只備用。按照正常的飲食進行對小鼠的喂養，溫度和濕度適宜。分為正常對照組、移植組和封閉血管內皮生長因子C組，移植組和封閉血管內皮生長因子C組中的20只小鼠分別進行角膜移植。

1.3 模型的構造

移植組和封閉血管內皮生長因子C組的20只小鼠，首先采用戊巴比妥鈉(0.5%，50mg/kg體重)全身麻醉聯合1%鹽酸奧布卡因點眼局部麻醉。麻醉后采用最新的角膜移植技術，分別對移植組和封閉血管內皮生長因子C組20只小鼠進行角膜移植。術后如果出現前房穿孔、晶體損傷脫位、虹膜出血粘連等并發癥的小鼠，均應該被淘汰，最后每組選取10只研究小鼠，術后按正常的護理營養進行喂養，放置的溫度濕度適宜小鼠生存。

2 實驗方法

2.1 具體實施

取上述小鼠模型進行實驗，3組小鼠中隨機挑選10只小鼠，移植組和封閉血管內皮生長因子C組的小鼠從無并發癥的移植小鼠中進行選取。在小鼠做完手術后，且無并發癥的前提下，正常組、移植組小鼠注射10mL/Kg的生理鹽水，封閉血管內皮生長因子C組注射等劑量的抗VEGF-C單克隆抗體，觀察實驗小鼠的效果。

2.2 數據的收集

正常對照組取兩只小鼠，移植組和封閉血管內皮生長因子C組分別在術后第3,7,10,14d分別取兩只小鼠進行取材。取小鼠右眼角膜，用甲醛固定24h后做成切片。完成切片制作后，取小鼠左眼的角膜，立即用-4℃丙酮液固定15min，常溫下PBS漂洗3次，加入0.3%Triton X-100液常溫下15min，5%BSA+山羊血清封閉1h。制作完標本后，使用對應的抗體進行免疫組化。去液、漂洗，注意避光，滴加抗熒光粹滅封片液封片，在熒光倒置相差顯微鏡下觀察拍照。測定VEGF-C的表達使用蛋白勻漿液5ml、苯甲基磺酰(PMSF)15μl、3-巰基乙醇5μl，充分混勻后，用離心機進行離心，1500r/min離心5min，去除上清液。制備好標本后，妥善保存，加入到電泳裝置中進行電泳實驗，通過觀察電泳的實驗結果，確定VEGF-C的表達含量。集取小鼠角膜移植成功后的存活率，通過裂隙燈觀察小鼠角膜內的渾濁程度，判斷角膜有沒有移植成功，通過對3組的分別計數可以容易地得到結果。

2.3 統計學分析

采用應用 SPSS21.0 統計軟件進行數據的處理。實驗數據以均數±標準差表示，組間使用方差分析比較，P<0.05證明數據在統計學上有顯著差異。

3 實驗結果

3.1 淋巴管的計數

表1說明正常對照組角膜緣有較少的淋巴管，沒有發現有新生的淋巴管。根據實驗結果表明移植組和封閉血管內皮生長因子C組新生的淋巴管明顯高于正常對照組，14d后新生的淋巴管達到高峰。移植組角膜緣發出的新生淋巴管數目比較集中、粗大，封閉血管內皮生長因子C組僅角膜緣生出樹枝狀粗短新生淋巴管芽，數目少且細小。

正常對照組

移植組

封閉VEGF-C組

表1 術后不同時間點各組角膜切片淋巴管的計數

組別3d7d10d14d正常對照組0000移植組1.35±0.083.01±0.293.27±0.252.89±0.17封閉VEGF-C組0.93±0.11?2.13±0.17?2.25±0.34?1.77±0.21#

注：對比移植組，*P<0.05,#P<0.01。

3.2 VEGF-C的表達

表2說明正常對照組角膜僅有少量的VEGF-C的表達，移植組的VEGF-C的表達顯著大于封閉血管內皮生長因子C組。結合表1說明，VEGF-C的表達和角膜新生淋巴管有很大的相關性，封閉血管內皮生長因子C有助于抑制淋巴管的增生。

表2 VEGF-C的表達量

組別正常對照組移植組封閉血管內皮生長因子C組VEGF-C的表達量0.264±0.0780.78±0.0860.282±0.028

注：對比移植組，P<0.05。

3.3 角膜移植存活小鼠計數

表3說明，正常對照組小鼠數量沒有變化，移植組的成功率顯著小于封閉血管內皮生長因子C組，說明血管內皮生長因子和小鼠的角膜移植存活密切相關。

表3 角膜移植存活小鼠計數(n=10)

組別3d7d10d14d正常對照組0000移植組9887封閉VEGF-C組10101010

注：P<0.05，在統計學上有顯著差異。

4 討論

角膜移植是利用異體的正常透明組織，取代混濁病變的角膜組織，使患眼復明或控制角膜病變[5]。角膜移植的成功率關乎很多盲人的切身利益，國家在有關方面做出了很多研究投入，希望能夠及早地降低角膜移植的失敗率。研究發現，血管內皮生長因子C、VEGFR-3及VEGF-D系統是一組能夠調節淋巴管生成的重要因子[6～7]。國內外研究表明，VEGF-C是已知的主要淋巴管形成生長因子，它通過對新生淋巴管內皮細胞的增殖和遷移的調控[8]，促進淋巴管的形成，從而導致角膜移植的失敗。如果抑制血管內皮生長因子C有可能降低角膜失敗的機率，本實驗是通過抑制VEGF-C因子，通過評比新生的淋巴管以及角膜的透光度來證明血管內皮生長因子C確實能夠抑制新生淋巴管和促進同種移植存活的作用。實驗表明，封閉血管內皮生長因子C確實能夠達到抑制新生淋巴管和促進同種移植存活的作用。但是實驗過程中也存在一定的缺陷，由于實驗的時間比較短無法觀察小鼠長期的移植存活率，以及在實驗的過程中使用單克隆抗VEGF-C抗體阻斷VEGF-C，不同濃度和劑量的單抗沒有做出深刻的研究，不知道到底哪種劑量和濃度抑制角膜的新生淋巴管最適宜，這也是下一步需要解決的問題。目前發現，介導角膜緣生成淋巴管的因子還有很多，比如整合素α9β1，吳靜[9]等人在這方面做出了研究，表明整合素α9β1對生成淋巴管有促進作用。角膜移植方面的研究還有很多需要探討的地方，關于VEGF-C因子如何促進淋巴管的增生以及對新生毛細血管是否有影響均是下步探討的內容。