外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中作用機制的研究進展

陳偉明,鹿洪亭

(青島大學附屬醫(yī)院，青島266003)

近些年來，越來越多的靶向藥物、免疫療法和液體活檢等在臨床上應用，大部分早期腫瘤患者都能得到有效的診療，但是仍有很多晚期癌癥患者因腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移而死亡。因此，對腫瘤轉(zhuǎn)移過程的進一步研究尤為重要。目前認為腫瘤轉(zhuǎn)移的過程包括原位瘤的腫瘤細胞侵襲突破基底膜滲入血管，在血液循環(huán)中存活，隨著血液傳播至遠端血管，附著并外滲出血管，最終在轉(zhuǎn)移部位定居和生長[1]。過去認為腫瘤細胞是通過細胞間的直接接觸和分泌可溶性蛋白因子(如細胞因子和生長因子)進行交流，但越來越多研究[2]表明，細胞和細胞之間也可以通過細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)進行信息交流。EVs是原核細胞和真核細胞釋放的所有類型囊泡的總稱，包括外泌體、微囊泡等[3]。外泌體(exosomes)是EVs中的一種直徑在30～150 nm，具有磷脂雙分子層的囊泡。在1979年，Trams等[4]首次使用“exosomes”這個詞來定義由正常細胞系和腫瘤細胞系質(zhì)膜來源的微囊泡。幾乎所有的活細胞均可以產(chǎn)生外泌體，其組成成分包括核酸(例如miRNA、lncRNA、DNA等)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，廣泛存在于血液、淚液、尿液、唾液、乳汁、腹水等體液中，是由母細胞膜內(nèi)陷形成的多囊泡體與膜融合后釋放到胞外，作用于鄰近或遠處的受體細胞[5]。對于外泌體的分離和鑒定方法仍存在較多的限制，但目前比較常規(guī)的方法是使用差速超速離心法來分離外泌體，通過蛋白免疫印跡、透射電子顯微鏡和納米粒子跟蹤分析對外泌體進行鑒別[6]。外泌體含有生物大分子參與細胞間信息交流，它們具有增加腫瘤細胞侵襲能力和促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，成為近年來腫瘤領域的研究熱點。近些年外泌體逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點，但目前國內(nèi)關于外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移的研究綜述仍缺乏對腫瘤轉(zhuǎn)移不同過程的系統(tǒng)闡述。因此，現(xiàn)將外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用機制相關報道綜述如下。

1 提高腫瘤的侵襲能力

腫瘤細胞想要傳播至宿主器官進行轉(zhuǎn)移，需要它們能突破基底膜、滲入和滲出血管。但不論是上述過程，還是腫瘤在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位的生長均和腫瘤微環(huán)境密切相關。腫瘤微環(huán)境除了腫瘤細胞，還含有大量的間充質(zhì)干細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞、細胞外基質(zhì)等成分。外泌體尤其是腫瘤細胞來源的外泌體(tumor derived exosomes, TDEs)在腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境之間的信息交流對促進腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用[7]。

1.1 促進腫瘤細胞的上皮—間質(zhì)化(EMT) Zomer等[8]證實，高侵襲性的腫瘤細胞來源的外泌體可增加低侵襲性腫瘤細胞的侵襲性。緊密連接是內(nèi)皮細胞和上皮細胞黏附復合物的主要組成部分，所形成的的天然屏障可以限制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。但是這種天然屏障會被TDEs破壞，從而促進腫瘤細胞滲入和滲出血管。TDEs中的miR-105可以下調(diào)靶基因ZO-1的表達，ZO-1作為緊密連接的重要組成成分，其表達下調(diào)可明顯減少緊密連接。在小鼠體內(nèi)實驗[9]證實高表達miR-105的TDEs能顯著提高腦轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并伴有內(nèi)皮細胞ZO-1表達下調(diào)和血管通透性增加。

EMT指的是上皮細胞失去上皮特征而獲得間質(zhì)特征的細胞過程。EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移過程密切相關，在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控下，上皮腫瘤細胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)出低增殖性、高侵襲和轉(zhuǎn)移能力，利于腫瘤的轉(zhuǎn)移；而當腫瘤細胞到達遠隔器官的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境時，將發(fā)生相反的間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，恢復其高增殖狀態(tài)，利于轉(zhuǎn)移瘤的生長[10]。抑癌基因P85α表達下調(diào)的間質(zhì)成纖維細胞來源的外泌體通過激活Wnt通路誘導癌細胞的EMT，從而促進乳腺癌腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[11]。高表達lncRNA-UCA1的膀胱癌細胞系，可通過外泌體傳遞lncRNA-UCA1至低表達lncRNA-UCA1的膀胱癌細胞系，通過EMT來促進腫瘤的侵襲和生長[12]。

1.2 參與血管生成 腫瘤的生長過程中會激活更多的新生血管生成，為自身輸送更多的營養(yǎng)血液，來避免腫瘤壞死的產(chǎn)生。TDEs介導腫瘤細胞與微環(huán)境之間的信息交流，在促進血管生成過程也發(fā)揮重要作用。鼻咽癌細胞來源的外泌體含有miR-23a作用于內(nèi)皮細胞，調(diào)節(jié)靶基因TSGA10的表達，促進血管生成[13]。含有miR-25-3p的TDEs進入內(nèi)皮細胞靶向KLF2和KLF4，調(diào)控VEGFR2、ZO-1，閉鎖蛋白的表達，提高血管通透性和促進新生血管生成。進一步動物實驗證實，外泌體中的miR-25-3p能顯著提高小鼠肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生[14]。TDEs還可作用于骨髓來源的間充質(zhì)細胞，誘導其分化為α平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, αSMA)陽性的肌成纖維細胞，后者又能提高腫瘤細胞增殖、侵襲能力和促進血管生成[15]。

1.3 參與形成免疫抑制微環(huán)境 TDEs可同時抑制細胞免疫反應和體液免疫反應來維持腫瘤細胞的增殖。TDEs和大多數(shù)免疫細胞之間都有聯(lián)系，通過多種途徑來干擾免疫細胞的功能，包括向免疫細胞傳遞耐受信號、抑制免疫細胞的增殖、誘導CD8+T細胞的凋亡、抑制NK細胞的活性、干擾單核細胞分化、使髓樣前體細胞分化成骨髓來源的抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)及促進調(diào)節(jié)性T細胞的分化和擴增，從而形成一個有利于腫瘤進展的免疫抑制微環(huán)境[16]。例如，上皮性卵巢癌來源的外泌體可通過下調(diào)NK細胞的NKG2D受體，來抑制NK細胞的細胞毒性作用[17]。活化的T細胞來源的外泌體通過Fas/FasL信號通路上調(diào)腫瘤細胞MMP9的表達，提高腫瘤細胞的侵襲能力，從而促進黑色素瘤和肺癌的轉(zhuǎn)移[18]。

2 在血液循環(huán)中協(xié)助腫瘤細胞逃脫免疫細胞攻擊

入血液的循環(huán)腫瘤細胞要想存活就必須逃過免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。血小板在協(xié)助腫瘤細胞免受免疫細胞的攻擊上發(fā)揮重要作用。血小板能黏附在循環(huán)腫瘤細胞表面，協(xié)助腫瘤細胞逃避NK細胞的殺傷作用[19]。此外，血小板還可增加腫瘤細胞的侵襲性。Pang等[20]證實凝血酶激活的血小板可誘導腫瘤細胞成為一種更具侵襲性的表型，而血小板膜蛋白p-選擇素和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)在協(xié)助于腫瘤細胞滲出血管中發(fā)揮重要作用?；罨难“宸置诘耐饷隗w(PMPs)也含有p-選擇素、GPⅡb/Ⅲa、生物活性脂類和分泌蛋白等，PMPs與腫瘤細胞共培養(yǎng)能顯著提高腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[21]。PMPs水平上調(diào)和腫瘤的進展以及不良的預后有關。Ⅳ期黑色素瘤患者PMPs在血液中的水平顯著高于Ⅲ期黑色素瘤患者，而且Ⅳ期黑色素瘤患者PMPs的血栓形成活性顯著升高[22]。

血液循環(huán)中的外泌體來源于多種活細胞，外泌體的數(shù)量、大小和所含功能性分子在不同疾病患者的血清、尿液、唾液等中均有明顯差異表達，因此能作為疾病診斷、進展和預后的重要生物標志物[23]。TDEs作為腫瘤診斷、進展和預后的生物標志物的顯著價值得到了越來越多的研究證實。例如，磷脂酰肌醇聚糖1(GPC1)陽性的外泌體在早期胰腺癌患者的血清中的水平就顯著高于正常人群[24]。腎細胞癌舒尼替尼耐藥相關的lncRNA ARSR可通過外泌體傳播舒尼替尼耐藥性，研究進一步證實，lncRNA ARSR通過和腫瘤細胞內(nèi)的miR-34/miR-449競爭性結(jié)合提高ALX和c-MET表達來促進舒尼替尼耐藥，因此，lncRNA ARSR可作為舒尼替尼耐藥的預測分子和治療靶點[25]。

3 參與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境建立和決定轉(zhuǎn)移器官傾向性

早在1889，Paget就提出了“種子和土壤假說”，認為只有在種子(循環(huán)腫瘤細胞)和土壤(宿主器官)相適應時，轉(zhuǎn)移瘤才會形成[26]。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的建立是腫瘤細胞定居于轉(zhuǎn)移部位所必須的，而且和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的器官傾向性密切相關。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成需要骨髓源性細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)細胞的共同作用[27]。

3.1 參與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的建立 腫瘤細胞來源的外泌體可教化受體細胞成為一種促轉(zhuǎn)移和促炎性的亞型，從而營造一個有利于腫瘤細胞定居的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[28]。含有miR-122的TDEs作用于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中的非癌性細胞，使后者細胞內(nèi)的丙氨酸激酶表達下調(diào)，減少對葡萄糖的攝取和利用，從而增加腫瘤細胞的營養(yǎng)支持[29]。胰腺導管腺癌TDEs可誘導小鼠肝臟轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，增加肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。機制上，胰腺導管腺癌TDEs可誘導肝竇內(nèi)的Kupffer細胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)和促使肝星狀細胞的纖維連接蛋白的表達上調(diào)，所形成的的纖維化環(huán)境可募集骨髓來源的巨噬細胞。TDEs中的巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)表達顯著增加，并且有利于轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成和促進腫瘤轉(zhuǎn)移。在和無轉(zhuǎn)移的胰腺腫瘤相比，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的Ⅰ期胰腺導管腺癌患者TDEs中的MIF水平明顯升高[30]。

3.2 引導腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性 腫瘤細胞來源的外泌體可直接靶向轉(zhuǎn)移部位，營造一個轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，為腫瘤細胞的定居和增殖做準備。通過綠色免疫熒光標記乳腺癌細胞來源的外泌體，在乳腺癌裸鼠模型中發(fā)現(xiàn)TDEs不僅在周圍的微環(huán)境中富集，還出現(xiàn)在血循環(huán)中以及轉(zhuǎn)移部位[31]。用具有肺轉(zhuǎn)移傾向的TDEs處理小鼠后可使具有骨轉(zhuǎn)移傾向的腫瘤細胞重新定向。而且不同器官傾向性的TDEs具有不同的整合素表達，整合素α6β4和α6β1與肺轉(zhuǎn)移相關，而整合素αvβ5與肝轉(zhuǎn)移相關[32]。

Zhang等[33]發(fā)現(xiàn)了另一種轉(zhuǎn)移器官特異性的有趣現(xiàn)象，為腫瘤轉(zhuǎn)移的機制研究提供了新的思路。正常表達PTEN的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到腦部后PTEN的表達下調(diào)，下調(diào)PTEN的腫瘤細胞離開腦部后PTEN的表達水平又會恢復，但在其他器官卻沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。研究進一步發(fā)現(xiàn)，星型膠質(zhì)細胞來源的外泌體轉(zhuǎn)載的miRNAs可作用于轉(zhuǎn)移腫瘤細胞并靶向PTEN。當下調(diào)星型膠質(zhì)細胞中靶向PTEN的miRNAs或者阻斷星型膠質(zhì)細胞分泌外泌體可抑制腦轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤細胞的PTEN丟失使得趨化因子CCL2分泌增加，募集Iba1陽性表達的骨髓來源的細胞，促進腫瘤細胞的增殖和抑制凋亡。

綜上所述，外泌體可在細胞和細胞之間傳遞信息，可通過提高腫瘤細胞的侵襲能力、誘導新血管生成、轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的建立和引導腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性等途徑促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，尤其在引導腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性上，為科研人員對腫瘤轉(zhuǎn)移的機制研究提供了新的方向。腫瘤患者和健康患者以及不同腫瘤進展階段的患者之間對比，血清中的TDEs所含內(nèi)容物成分的差異表達，為臨床上對腫瘤的診斷、治療和預后評估提供了更多生物標志物的選擇。腫瘤細胞基因水平和蛋白水平在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的機制探討是一項巨大的長期工程，但外泌體作為腫瘤細胞信息傳遞的關鍵途徑，對其內(nèi)含物所包含的有限信息的進一步探索，一定會在未來幾年里為腫瘤的診療策略上提供強有力的指導。