T1期直腸癌淋巴結轉移相關臨床病理因素分析

鄒霜梅 陳宏達 方慶 李江濤 劉秀云 呂寧

作者單位：100021 北京，國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院病理科1；癌癥早診早治辦公室2

鄒霜梅, 陳宏達, 方慶, 等. T1期直腸癌淋巴結轉移相關臨床病理因素分析[J/CD].中華結直腸疾病電子雜志, 2019,8(1): 23-31.

近年來，中國結直腸癌的發病率和死亡率在逐年上升，我國每年結直腸癌新發病例和疾病特異性死亡病例約191 000和376 300人［1］。T1期結直腸癌的定義是腫瘤穿透結直腸黏膜肌層累及黏膜下層但沒有累及固有肌層［2］。根治性手術顯示T1期結直腸癌總的淋巴結轉移率為8.2%～16.3%［3］。Kobayashi的研究結果顯示T1期直腸癌淋巴結轉移率為13.1%。根治性切除后有淋巴結轉移和沒有淋巴結轉移者T1期直腸癌5年總生存率分別為82.1%和93.8%。伴有淋巴結轉移的T1期直腸癌復發率為 25.0%［4］。

根治性手術和局部切除手術都是T1期直腸癌可以選擇的治療方式。但是，近年來的研究結果顯示T1期直腸癌經肛內鏡微創手術和根治性手術比較前者的局部復發率和總的復發率均明顯高于根治性手術［5］。超過10%的患者為非治愈性的內鏡切除，術后必須接受補充手術以預防局部復發和轉移。在治療前和局部切除術后準確地評價患者復發和轉移的危險因素，有利于治療方式的選擇及預后的判斷。對于高復發轉移風險的患者推薦進一步的根治性手術和隨訪，避免低風險患者的過度治療，達到手術風險和收益的平衡［6］。

T1期結直腸癌局部切除術后是否需補充根治性手術主要是根據病理學指標評價復發轉移的風險大小。文獻中報告的與T1期結直腸癌復發轉移相關的因素約40余種［7］，目前僅幾個指標研究較多，并且已作為較為明確的淋巴結轉移風險預測因素寫入相關的指南中，但是在世界范圍內還沒有統一標準。本次研究采用中國醫學科學院腫瘤醫院根治性手術切除的T1期直腸癌標本進行回顧性分析，研究影響其復發及轉移的組織病理學指標及分子標志物，并體現在病理報告中，為臨床治療方式的選擇提供依據。

資料和方法

一、病例選擇

本項研究選取1999年1月至2017年12月在中國醫學科學院腫瘤醫院根治性手術切除的連續性T1期直腸癌病例共計251例。直腸癌的定義是腫瘤距肛緣15 cm以內。排除標準包括家族性腺瘤性息肉病、炎癥性腸病和同時性進展期結直腸癌患者。

二、組織病理形態學指標及評價標準

（一）組織病理學評價指標

病例的全部HE切片經過兩位病理醫生復閱，分析相關臨床組織病理學指標，包括患者的性別、年齡、腫瘤大小、黏膜肌狀態、腫瘤浸潤深度、腫瘤大體類型、是否有腺瘤背景、腺瘤的類型、腫瘤分化程度、腫瘤組織學亞型、低分化腫瘤細胞 簇（poorly differentiated clusters，PDC）、 腫瘤出芽（tumor budding，TB）、淋巴管血管侵犯（lymphovascular invasion，LVI）、靜脈侵犯（venous invasion，VI）、神經侵犯、壞死、腫瘤浸潤最深處的腺體形態等與淋巴結轉移、遠處轉移和生存的關系。

（二）組織病理學指標的評價標準

1.腫瘤大體分型：根據Kouyama的標準分為息肉型（0-Ⅰ型）和平坦型（0-Ⅱ型）［8］。

2.腫瘤浸潤深度：絕對值分別按照息肉型和平坦型的不同標準進行評價，參考Ueno和Nakadoi的方法［9-10］。

3.黏膜肌狀態：通過免疫組織化學（immunohistochemstry，IHC）抗體Desmin染色顯示。根據Nakadoi首次提出的組織形態標準，將黏膜肌分成3種類型：A型：清晰辨認；B型：不完全消失；C型：完全消失［11］。

4.腺瘤背景：定義為良性腺瘤組織與切除的癌組織延續。根據癌組織邊緣或表面是否有腺瘤性息肉或鋸齒狀息肉成分分成無腺瘤背景的腺癌或有腺瘤背景的腺癌［12］。

5.腺瘤組織學分類：根據WHO 2010年結直腸癌組織學分類標準。以篩狀結構為主的腺癌單獨用于分析［13］（圖1）。

6. PDC：低分化腫瘤細胞簇的定義是惡性腫瘤細胞簇≥5個腫瘤細胞，缺乏腺管分化。分級診斷標準為選擇一個PDC最多的區域，在10倍目鏡，20倍物鏡（0.785 mm2）計數PDC的個數：1級＜5個，2級 5～9個，3級≥ 10個［14］。

7. TB：TB的定義是1～4個腫瘤細胞組成的小巢出現在腫瘤浸潤的最深處的前端。分級診斷標準是選擇一個出芽最多的區域，在10倍目鏡，20倍物鏡（0.785 mm2）下計數出芽的數量：1級，0～4；2 級：5～9；3 級：10 個及以上［9，15］。

8.淋巴管血管侵犯（lymphovascular invasion，LVI）：評價方法是腫瘤細胞出現在間質的薄壁血管或淋巴管腔隙里。采用免疫組化染色D2-40和CD31用于識別血管或淋巴管。

9.靜脈侵犯（venous invasion，VI）：采用維多利亞蘭（Victoria blue）法進行彈力纖維特殊染色識別肌壁內靜脈侵犯，對于T1期結直腸癌，指黏膜下靜脈侵犯。

10.神經侵犯：評價方法是腫瘤細胞圍繞在黏膜下層的神經周圍。

11.腺體狀態：腺體狀態的定義是在腫瘤浸潤最深處，80%以上腺體形狀完整為閉合型，20%以上腺體出現斷裂和不完整為開放型（圖2）。

三、特殊染色及免疫組織化學染色分析

免疫組化染色采用抗體CD31（UMAB30，工作液，邁新公司），Desmin（D33，工作液，邁新公司），D2-40（D2-40，工作液，邁新公司）。采用Ventana Benchmark Ultra免疫組化儀，超敏一步法聚合物染色系統（UltraView Multimer）顯色。彈力纖維染色采用維多利亞藍法。彈力纖維呈藍色、細胞核呈紅色。

四、隨訪

隨訪資料包括是否復發或轉移、復發或轉移的時間、轉移部位、是否死亡、死亡時間、死亡原因、最近一次的隨訪時間、術后是否接受化療、化療方案、化療周期、副作用情況等?？偵媛剩╫verall survival，OS）觀察終點為死亡。

五、統計學分析

采用R3.3.2統計軟件建立數據庫并進行統計分析。根據研究目標，分別采用有無轉移淋巴結、有無腺瘤背景、大體類型等作為結局終點事件，描述不同組間的病理特征分布，采用χ2檢驗（分類變量）或Wilcoxon秩和檢驗（連續變量）比較不同組別間的差異。通過單因素分析篩選出與結局變量相關的危險因素，并采用多元logistic回歸進一步分析相關危險因素與結局變量的關聯，計算相應危險因素的比值比（OR）和95%置信區間（95%CI）。根據隨訪結果采用SPSS 22.0統計軟件，Kaplan-Meier法繪制不同組別的生存曲線，采用Log-Rank法比較其差異性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者基本信息

圖1 伴有篩狀結構的癌。1A：篩狀結構為主的腺癌；1B：篩狀粉刺樣癌；1C：腺腔內壞死（HE 100×）

圖2 癌浸潤深處腺體狀態（HE染色）。2A、2B、2C：閉合型，浸潤最深處為完整的腺體；2D、2E、2F：開放型，浸潤最深處為開放的腺體；2D：伴有間質反應；2E：伴有大量中性粒細胞；2F：伴有壞死；2G、2H、2I：伴隨腺體的破壞產生PDC和TB（箭頭）

共計251例連續性T1期直腸癌根治性手術患者用于研究。其中男性123例，女性128例，中位年齡60歲（23～81歲）。根據AJCC第七版病理分期，其中28例有淋巴結轉移，淋巴結轉移率（11.2%）。N0期223例（88.8%），N1a期14例（5.6%），N1b期9例（3.2%），N1c期1例（0.3%），N2a期3例（1.2%），N2b期1例（0.3%）。所有病例手術時均為cM0期。臨床TNM分期：Ⅰ期223例（88.8%），Ⅲ期28例（11.2%）。所有的病例均未經術前新輔助放、化療，11例經過術后輔助放化療，4例有淋巴結轉移癌的患者術后輔助放化療。

二、組織病理學指標評價結果

1.腫瘤大?。耗[瘤平均最大直徑2.37 cm（0.6 cm～7 cm）。腫瘤直徑1 cm及以下17例（6.8%），沒有淋巴結轉移；直徑1 cm～2 cm者112例（44.6%），淋巴結轉移14例（12.5%）；直徑2 cm以上者122例（48.6%），淋巴結轉移14例（11.5%）。

2.腫瘤大體類型：息肉型98例（39.1%），平坦型153例（60.9%）。

3.浸潤深度絕對值：（1）平坦型：浸潤深度平均 7 510 μm（100 μm～18 000 μm），浸潤深度＜1 000 μm 3例（1.9%），≥1 000 μm 150例（98.1%）。（2）息肉型：1 838 μm（200 μm～6 000 μm）。浸潤深度＜ 1 000 μm 4例（4.1%），≥ 1 000 μm 94例（95.9%）。

4.黏膜肌狀態：A型（清晰辨認）4例（1.6%），B型（不完全消失）39例（15.5%），C型（完全消失）208例（83%）。

5.腺瘤背景：無腺瘤背景的腺癌55例（22%），淋巴結轉移14例（25.5%）；有腺瘤背景的腺癌196例（78%），淋巴結轉移14例（7.1%），差異有統計學意義（P＜0.01）。

6.腫瘤病理組織學類型：篩狀型為主的腺癌共84例（33.5%），淋巴結轉移15例（17.9%）；其中篩狀粉刺樣癌15例（6%），淋巴結轉移6例（40%）。

7.低分化腫瘤細胞簇：無149例（59.4%），低級別38例（15.1%），高級別64例（25.5%）。

8.TB：無101例（40.2%），低級別42例（16.7%），高級別108例（43.0%）。

9.淋巴管血管侵犯：無177例（70.5%），有74例（29.5%）。

10.黏膜下靜脈侵犯：無176例（70.1%），有75例（29.9%）。

11.神經侵犯：無229例（91.2%），有22例（8.8%）。

12.腫瘤浸潤最深處的腺體狀態：腺體閉合型84例（33.5%）、腺體開放型167例（66.5%）。

三、淋巴結轉移和無淋巴結轉移的T1期直腸癌臨床病理特征差異性分析

（一）與T1期直腸癌淋巴結轉移相關的臨床病理特征

251例T1期直腸癌根治性切除標本中，有淋巴結轉移28例（28/251，11.2%）。單因素分析顯示有淋巴結轉移的病例平均年齡大于無淋巴結轉移病例（60.0±10.0 vs 56.1±10.2，P=0.05）；無腺瘤背景的腺癌（P＜0.01）、腺瘤成分為管狀腺瘤（P＜0.01）、組織學分化為高級別癌（P＜0.01）、組織學有篩狀結構（P=0.03）、有高級別PDC（P=0.02）或TB（P=0.01）、有淋巴管血管侵犯（P＜0.01）、有黏膜下靜脈侵犯（P＜0.01）、浸潤深部腺體為開放型（P=0.04）淋巴結轉移率高；患者性別、腫瘤大體類型、腫瘤大小、黏膜肌狀態、浸潤深度、有無神經侵犯、有無壞死在兩組之間差異無統計學意義（詳見表1）。

多因素logistic回歸分析顯示，患者年齡（P=0.02）、無腺瘤背景（P＜0.01）、組織學高級別癌（P=0.04）、黏膜下靜脈侵犯（P=0.02）是淋巴結轉移的獨立危險因素（詳見表2）。

（二）腫瘤浸潤深度與淋巴結轉移的關系

腫瘤浸潤深度結果顯示，浸潤深度＜1 000 μm的病例沒有出現淋巴結轉移。在平坦型病變中，出現淋巴結轉移的最小浸潤深度為1 200 μm；如果不伴有其他危險因素，包括組織學高級別癌、PDC、TB、淋巴管血管侵犯、黏膜下靜脈侵犯時，2例出現淋巴結轉移，浸潤深度分別為6 400 μm和6 500 μm。息肉型病變中，出現淋巴結轉移的最小浸潤深度為2 000 μm；如果不伴有其他危險因素包括組織學高級別癌、PDC、TB、有淋巴管血管侵犯、黏膜下靜脈侵犯時，沒有出現淋巴結轉移。

表1 T1期直腸癌淋巴結轉移組和無轉移組臨床病理特征單因素分析（例，%）

續表

續表

表2 T1期直腸癌淋巴結轉移和無轉移組臨床病理特征多因素分析

（三）腫瘤浸潤深部腺體狀態和臨床病理特征的關系

腫瘤浸潤最深處的腺體狀態，腺體閉合型84例（33.5%）、腺體開放型167例（66.5%）。腺體的開放型顯示通常伴有癌組織中腺體結構內的壞死和炎癥細胞浸潤，特別是中性粒細胞浸潤（圖2），部分腺體的開放伴隨有腺體癌細胞的脫落，形成TB和低分化腫瘤細胞簇。單因素分析顯示，腺體的開放型與淋巴結轉移相關（P=0.04）。多因素分析未顯示與淋巴結轉移的關系，腺體的開放型還顯示與腫瘤大體平坦型（P=0.03），無腺瘤背景（P=0.03），黏膜肌完全消失（P=0.05）、高級別腫瘤出芽（P＜0.001）和腫瘤內壞死（P＜0.001）有關。

四、病例隨訪結果

病例平均隨訪時間為63.4個月（5～223個月）。隨訪120個月，失訪35例（35/251，13.9%）。3年、5年和10年的總生存率分別為98.6%，96.8%，94.9%。有淋巴結轉移的3年、5年和10年的總生存率分別為100%，95.6%和90.9%；無淋巴結轉移的3年、5年和10年的總生存率分別為99%，96.9%和95.4%，高于有淋巴結轉移組。淋巴結轉移組和無轉移組的總生存率差異無統計學意義（圖3）。手術后復發部位為肺、肝、會陰。術后5年復發率3.2%，10年復發率4.6%。

圖3 T1期直腸癌淋巴結轉移組和無轉移組生存分析

討 論

T1期結直腸癌的總體預后較好。研究影響T1期直腸癌復發和轉移的因素，有助于臨床醫生選擇適當的治療方式及判斷預后，特別是對于低位直腸癌患者，可避免低風險患者的過度治療，改善患者的生活質量［6］。

表淺結直腸癌大體類型分為息肉型和平坦型。我們的研究顯示，平坦型153例（60.9%），息肉型98例（39.1%），淋巴結轉移率分別為12.4%和9.2%，平坦型淋巴結轉移率較高，但差異無統計學意義（P=0.56）。平坦型和息肉型的總生存率差異也無統計學意義。但是，平坦型腺癌還表現出浸潤深度深，無腺瘤背景腺癌的比例高，伴有絨毛狀腺瘤成分較多，篩狀結構為主的癌較多和伴有TB多的不良病理學特征。

伴隨腫瘤的黏膜下層浸潤會導致黏膜肌層形態改變，Nakadoi等［11］首次根據黏膜肌的組織形態進行分型，單因素和多因素分析顯示C型與淋巴結轉移有明顯相關性，同時與淋巴管侵犯有關。按照這個分類方法，我們的病例經免疫組化染色明確黏膜肌狀態后顯示，83%的病例為C型，但黏膜肌狀態未顯示與淋巴結轉移的相關性。

我們采用了測量黏膜下層浸潤深度絕對值的方法明確腫瘤浸潤深度［9，16-17］。根據JSCCR的研究結果，黏膜下浸潤深度≥1 000 μm的淋巴結轉移率是12.5%，推薦黏膜下浸潤深度≥1 000 μm作為補充手術的標準［18］。我們的結果顯示，無論是平坦型或是息肉型病變，黏膜下層浸潤深度＜1 000 μm的病例均未出現淋巴結轉移，支持上述觀點。但是，我們也注意到＜1 000 μm的病例僅7例（2.7%），對≥1 000 μm的病例有必要進一步分層。我們發現在平坦型病變中，出現淋巴結轉移的最小浸潤深度為1 200 μm；如果不伴有其他組織學危險因素，如高級別癌、PDC、TB、淋巴管血管侵犯、黏膜下靜脈侵犯時，僅2例（0.7%）出現淋巴結轉移，浸潤深度分別為6 400 μm和6 500 μm。息肉型病變中，出現淋巴結轉移的最小浸潤深度為2 000 μm；如果不伴有其他組織學危險因素時，沒有出現淋巴結轉移。其他研究也顯示如果僅有浸潤深度≥1 000 μm一個危險因素，淋巴結轉移率僅為1.2%～2.2%［19-20］。Ueno 等［13］研究顯示浸潤深度以2 000 μm為標準淋巴結轉移率才有明顯差異。Nakadoi等［10］研究顯示如果沒有其他的危險因素，黏膜下層浸潤超過1 800 μm才出現淋巴結轉移。根據上述研究結果，我們與JSCCR的觀點一致，即除黏膜下層浸潤深度以外，還要考慮患者的生理和社會因素以及意愿［18］，并要結合其他危險因素綜合考慮。

Han等［12］研究顯示，沒有腺瘤背景的腺癌和有腺瘤背景的腺癌顯示出一些不同的臨床病理特征。原發腺癌腫瘤較?。ㄍǔ＃?0 mm），分化較差，大體為扁平或凹陷型，黏膜下浸潤深度更深，淋巴結轉移率更高，TB分級高，提示原發腺癌有更強的侵襲性［21-22］。我們的研究得到了一致的結果，這兩種類型的直腸癌發生的分子機制值得進一步研究。

篩狀粉刺樣癌是獨立的組織學類型，但是文獻中報道很少，這種類型的癌被認為惡性程度高，預后較差［13，23-24］。我們的病例中，篩狀型為主的腺癌共84例（33.5%），其中淋巴結轉移15例（17.9%）；篩狀粉刺樣癌15例（6%），其中淋巴結轉移達6例（40%）。單因素分析顯示，以篩狀結構為主的腺癌淋巴結轉移率高（P=0.03），證實篩狀結構是高級別的組織學類型。

TB和PDC是近年來提出的病理學指標，是T1期結直腸癌淋巴結轉移的危險因素［15，20］。Ueno等對3 556例T1期結直腸癌進行多中心回顧性研究顯示，39.4%T1期結直腸癌中有PDC，淋巴結轉移率在PDC陽性和陰性腫瘤中分別為17.4%和 6.9%（P＜0.001）［13，17］。我們的病例中，單因素分析顯示高級別TB和PDC是淋巴結轉移的危險因素（分別為P=0.01，P=0.02），但多因素分析未顯示出與轉移的關系。

淋巴管血管侵犯包括淋巴管和毛細血管侵犯，統稱為小血管受侵，而不必區分淋巴管和血管［9］。多項研究顯示淋巴管血管侵犯是T1期結直腸癌淋巴結轉移及復發的獨立預后因素［20］。HE染色的標本中經常難以辨認內皮細胞，出現的腔隙可能是標本制備過程中的假象。僅用HE染色評價淋巴管血管侵犯的陽性率為5%～54%，平均17%，不同研究中的陽性率差異較大。D2-40和CD34免疫組化染色有助于識別淋巴管和毛細血管侵犯［18］。使用免疫組化方法的發現淋巴管血管侵犯陽性率為32.3%～35%，平均34%［13，25-26］，提示免疫組化染色有助于更加準確發現淋巴管血管侵犯，結果更為穩定可靠。我們采用免疫組織化學染色的方法，發現有淋巴管血管侵犯74例（29.5%）。單因素分析顯示淋巴管血管侵犯是淋巴結轉移的危險因素（P＜0.01）。

大血管受侵一般指靜脈侵犯。靜脈侵犯是影響疾病進展和生存的獨立預后因素。靜脈壁結構有平滑肌和彈力纖維，使用特殊染色方法，如elastica van Gieson（EVG）染色或Victoria blue染色有助于識別靜脈侵犯，可以使靜脈侵犯的發現率增加近3倍［27］。我們的病例中，黏膜下靜脈侵犯有75例（29.9%）。單因素分析和多因素分析均顯示黏膜下靜脈侵犯栓是T1期直腸癌淋巴結轉移的危險因素（P＜0.01和P=0.02）。

黏膜下層浸潤前端的腺體形態是我們首次提出的組織學特征，將其定義為在腫瘤浸潤最深處，80%以上腺體形狀完整為閉合型，20%以上腺體出現斷裂和不完整為開放型。我們的病例中，腺體閉合型84例（33.5%）、腺體開放型167例（66.5%）。腺體的開放型通常伴有癌組織中腺體結構內的壞死和炎癥細胞浸潤，特別是中性粒細胞浸潤，部分腺體的開放伴隨有腺體破壞和癌細胞的脫落，形成TB和低分化腫瘤細胞簇的形態。單因素分析顯示，腺體的開放型與淋巴結轉移相關（P=0.04）。腺體的開放型還顯示與腫瘤大體平坦型（P=0.03）、無腺瘤背景（P=0.03）、黏膜肌完全消失（P=0.05）、高級別腫瘤出芽（P＜0.001）和腫瘤內壞死（P＜0.001）的不良組織學形態有關。提示腺體狀態可能作為T1期直腸癌淋巴結轉移的預測因素，但需要更多的病例進一步驗證，這種形態學表現的成因以及腫瘤與炎癥反應和預后的相關性也需要進一步研究。

本項研究有一些局限性，首先，這是一個單中心的回顧性研究，有一些病例在隨訪過程中失訪，可能對研究結果產生影響，需要多中心更多的病例進行驗證。其次，選擇的病例均為根治性手術的患者，而近年來本中心內鏡下切除的T1期直腸癌比例在逐年增加，進行根治性手術的患者可能是在術前評價為內鏡下切除不能治愈的患者，屬于相對較晚的早期患者，因此會出現病例選擇偏移的問題。故根據上述結果對內鏡下切除的T1期腸癌患者進行評價和長期的隨訪觀察研究十分必要。

本項研究重點關注于與患者生活質量和臨床處置關系密切的T1期直腸癌患者，結果驗證了無腺瘤背景的腺癌、組織學為高級別的癌、黏膜下靜脈侵犯、高級別PDC和TB、淋巴管血管侵犯與T1期直腸癌淋巴結轉移相關。此外，我們還提出了篩狀結構、腺體為開放型與淋巴結轉移具有相關性。