LAMP技術(shù)在家禽腹瀉性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

董雯雯 張世棟 王春玲 艾洪新 李新華 潘力 朱偉 李峰*

LAMP技術(shù)在家禽腹瀉性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

董雯雯①?gòu)埵罈潰偻醮毫幄侔樾垄倮钚氯A①潘力①朱偉②*李峰①*

（②山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東 濟(jì)南 250023 ②山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊）

快速檢測(cè)致病微生物是控制疾病暴發(fā)的有效方法之一。目前，測(cè)病原體的傳統(tǒng)方法耗時(shí)且勞動(dòng)強(qiáng)度大，并且通常很容易失去最佳控制疾病的機(jī)會(huì)。因此，迫切需要一種快速檢測(cè)疾病的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是近年來(lái)新建立的核酸恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)。它具有高靈敏度，特異性，視覺(jué)檢測(cè)和對(duì)儀器的低需求。它具有節(jié)省時(shí)間和精力等諸多優(yōu)點(diǎn)，在分子診斷領(lǐng)域具有很大的潛力。目前，LAMP已被廣泛用于檢測(cè)各種動(dòng)物病原微生物。本文主要綜述了LAMP技術(shù)在家禽腹瀉病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用以及LAMP技術(shù)的改進(jìn)和優(yōu)化，為快速檢測(cè)家禽腸道疾病提供了參考。

目前，熒光定量、間接免疫熒光等分子生物學(xué)技術(shù)在家禽病原檢測(cè)中起著關(guān)鍵作用，但都需要昂貴的儀器設(shè)備及一定操作技能。一旦出現(xiàn)疫情，基層養(yǎng)殖場(chǎng)及實(shí)驗(yàn)室很難實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的快速檢測(cè)[1]。針對(duì)這一現(xiàn)象，Notomi等[2]于2000年研發(fā)出一種新的DNA擴(kuò)增技術(shù)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LA MP)。該方法在各項(xiàng)指標(biāo)上優(yōu)于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，且不需要昂貴的儀器設(shè)備、簡(jiǎn)便、快速、靈敏，僅需在引物及BstDNA聚合酶的催化下，等溫水浴30~ 60min，即可實(shí)現(xiàn)靶基因109倍擴(kuò)增[3]，檢測(cè)成本較低，適合基層地區(qū)開(kāi)展病原微生物的早期診斷和篩查。目前LAMP的檢測(cè)對(duì)象已經(jīng)覆蓋了核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等，展現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 LAMP技術(shù)原理

（1）LAMP技術(shù)是在等溫(60~65℃)條件下利用BstDNA聚合酶和靶基因4條特異性引物進(jìn)行反應(yīng)，最后實(shí)現(xiàn)基因的指數(shù)型擴(kuò)增，具有高度靈敏性和特異性。本項(xiàng)技術(shù)針對(duì)設(shè)計(jì)的4條特異性引物具有嚴(yán)格的要求，分別為正向內(nèi)部引物FIP，反向內(nèi)部引物BIP，正向外部引物F3和反向外部引物B3。這幾對(duì)引物的特點(diǎn)是能夠同時(shí)識(shí)別目標(biāo)序列的6個(gè)特異性片段，從而賦予LAMP很高的特異性[4]。（2）LAMP反應(yīng)在BstDNA聚合酶的催化下進(jìn)行，F(xiàn)IP，F(xiàn)3與模板序列結(jié)合，形成循環(huán)模板，在F3延伸過(guò)程中，F(xiàn)IP產(chǎn)生的延伸鏈被置換出來(lái)，與5’端進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。BIP與B3再以此為模板序列，在BstDNA聚合酶的作用下進(jìn)行下一輪鏈置換反應(yīng)，形成啞鈴狀單鏈DNA，被置換的鏈自身形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)接著與內(nèi)引物結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增和鏈置換，新合成兩倍長(zhǎng)度的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，最后形成多個(gè)重復(fù)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5]。此外，在反應(yīng)體系中加入兩條環(huán)引物可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。

2 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)

2.1 電泳檢測(cè)法

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物為多個(gè)不同長(zhǎng)度的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)DNA混合物，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行鑒定。結(jié)束反應(yīng)后，取10μl產(chǎn)物，加入熒光染料進(jìn)行電泳，最后用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行電泳呈現(xiàn)階梯狀目的條帶。

2.2 濁度檢測(cè)法

（1）由于LAMP反應(yīng)放大效率高，反應(yīng)過(guò)程中可消耗大量脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，dNTPs被消耗使用后則產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，該離子會(huì)與溶液中Mg2+結(jié)合而產(chǎn)生焦磷酸鎂，而使反應(yīng)液呈現(xiàn)白色。因此，經(jīng)肉眼觀(guān)察反應(yīng)液的渾濁度也可以作為一種判定標(biāo)準(zhǔn)。（2）還可以用濁度儀在400nm波長(zhǎng)下檢測(cè)反應(yīng)是否發(fā)生，并且可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)[6]，簡(jiǎn)單快捷。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀相比，濁度儀價(jià)格便宜，是比較常用的檢測(cè)工具。

2.3 熒光檢測(cè)法

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物還可以通過(guò)加入SYBR Green I、鈣黃綠素等熒光染料/金屬離子指示劑進(jìn)行判斷。SYBRGreenI在游離狀態(tài)下通常顯示微弱熒光，當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，LAMP陽(yáng)性反應(yīng)過(guò)程中在SYBR Green I 指示下反應(yīng)液由原色橘黃色轉(zhuǎn)為陽(yáng)性綠色。鈣黃綠素則是另一種LAMP熒光指示劑，在陰性反應(yīng)下，鈣黃綠素會(huì)與反應(yīng)液中加入的錳離子結(jié)合，熒光消失。陽(yáng)性反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸根離子與錳離子結(jié)合，釋放鈣黃綠素，鈣黃綠素再與溶液中鎂離子結(jié)合，熒光增強(qiáng)。此種檢測(cè)方法簡(jiǎn)單便捷，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要開(kāi)蓋即可進(jìn)行結(jié)果判斷，避免交叉污染。

3 LAMP技術(shù)在致家禽腹瀉疾病檢測(cè)的應(yīng)用

3.1 家禽細(xì)菌性腹瀉疾病檢測(cè)

3.1.1 禽致病性大腸桿菌的檢測(cè) 禽致病性大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌引起各日齡禽類(lèi)多種病的總稱(chēng)，該病易引起混合感染，造成極大經(jīng)濟(jì)損失。梁玉林等[7]針對(duì)大腸桿菌O157保守序列rfb E設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，通過(guò)引物篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了檢測(cè)大腸桿菌的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)方法。對(duì)比PCR方法結(jié)果顯示，RT-LAMP方法在等溫65℃條件下，30min內(nèi)能完成擴(kuò)增反應(yīng)，所建立的RT-LAMP方法具有較強(qiáng)的特異性。同時(shí)該方法靈敏度能達(dá)到20 CFU/g，高出PCR方法10倍。

3.1.2 沙門(mén)氏菌的檢測(cè) 沙門(mén)氏菌病是一種常見(jiàn)的重要人畜共患病原菌，嚴(yán)重危害家禽腸道健康，本病發(fā)病率高，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。李迎曉等[8]建立了一種沙門(mén)菌LAMP檢測(cè)方法，依據(jù)GenBank公布的沙門(mén)菌屬fimY基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，并對(duì)其特異性和敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，LAMP方法具有較強(qiáng)的特異性，最低可檢出濃度為56×102CFU/ml，靈敏度高于PCR方法10倍。王瑾等[9]根據(jù)沙門(mén)氏菌inv A基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用Midori Green新型核酸熒光染料，建立了沙門(mén)氏菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(reahime fluorescence LAMP，RTF-LAMP)檢測(cè)方法，檢測(cè)過(guò)程僅需45min，靈敏度達(dá)6CFU/管，其靈敏性和準(zhǔn)確性與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法相當(dāng)，但檢測(cè)時(shí)間可縮短至7h。

3.1.3 金黃色葡萄球菌的檢測(cè) 葡萄球菌是由金黃色葡萄球菌等感染引起的人畜共患傳染病，目前已產(chǎn)生多數(shù)耐藥性，因此快速、準(zhǔn)確檢測(cè)耐藥性細(xì)菌對(duì)于預(yù)防此類(lèi)細(xì)菌感染具有重要意義。張濤濤等[10]根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc中的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立并優(yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果表明，在環(huán)引物的作用下，LAMP反應(yīng)體系于60℃反應(yīng)35min即可完成擴(kuò)增，未加環(huán)引物下則需45min才能看到白色絮狀沉淀。對(duì)保存到的其他菌株進(jìn)行同步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)2株金黃色葡萄球菌均顯示陽(yáng)性，其他菌株顯示陰性，LAMP檢測(cè)最低檢測(cè)限為100 fg，低于PCR最低檢測(cè)限2個(gè)數(shù)量級(jí)。

3.1.4 巴氏桿菌的檢測(cè) 禽巴氏桿菌病又稱(chēng)禽霍亂，該病主要引起多種家禽、野禽發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難，發(fā)病率及死亡率較高，目前尚無(wú)良好的治療方法，嚴(yán)重?fù)p害養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。為建立同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌、禽源多殺性巴氏桿菌和鴨疫里默氏菌等水禽常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)間接PCR方法，程等人[11]根據(jù)大腸桿菌的gapA基因、禽源多殺性巴氏桿菌的KMT1基因、鴨疫里默氏菌的OmpA基因序列，分別設(shè)計(jì)引物、標(biāo)記至豬線(xiàn)粒體基因片段的兩端，制備不同細(xì)菌的捕獲探針，將捕獲探針與待檢測(cè)菌的基因組雜交、補(bǔ)平缺口、環(huán)化。采用1對(duì)引物反向擴(kuò)增捕獲探針，建立檢測(cè)水禽3種常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)間接PCR方法，特異性檢測(cè)中沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌、小鵝瘟病毒的檢測(cè)結(jié)果為陰性。該方法能檢測(cè)出100pg的細(xì)菌基因組DNA，與常規(guī)PCR的符合性為100%。

3.1.5 鴨疫里默氏桿菌的檢測(cè) 鴨疫里默氏桿菌是鴨產(chǎn)業(yè)中最有害的傳染性病原體之一[12]，感染鴨群主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、下痢等。陳紅梅等[13]利用RA ompA蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)LAMP特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，驗(yàn)證得到在65℃孵育80min，即可達(dá)到擴(kuò)增效果，本方法對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等檢測(cè)均為陰性，靈敏性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法對(duì)RA ompA最低檢測(cè)限度為800fg。Han等[14]針對(duì)RA GroEL基因保守片段，設(shè)計(jì)了3對(duì)LAMP特異性引物，建立了一種適用于RA多種基因型的LAMP檢測(cè)方法。該方法能在65℃恒溫下，20min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的核酸的擴(kuò)增，可以檢測(cè)出細(xì)菌量的最低限度為l0CFU，其靈敏度為普通PCR50倍。

3.2 家禽DNA病毒性腹瀉疾病檢測(cè)

3.2.1 禽腺病毒的檢測(cè) 禽腺病毒(FAdV)在臨床上主要為包涵體感染，繼而出現(xiàn)呼吸道感染、出血性腸炎，及產(chǎn)蛋量降低，造成一定經(jīng)濟(jì)損失。白元斌[15]根據(jù)GenBank已公布禽腺病毒血清4型(FAdV-4)Hexon基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)LAMP引物，優(yōu)化反應(yīng)體系為61℃，反應(yīng)30 min。與普通PCR檢測(cè)相比LAMP方法具有更高的靈敏度，檢測(cè)下限為6.4fg/μl。對(duì)采集的臨床發(fā)病雞21份肝臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，常規(guī)PCR檢出率19%，LAMP檢出率26%。Zhai等[16]研究出用于檢測(cè)FAdV-4的循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增耦合與側(cè)向流量試紙(LAMP-LFD)，優(yōu)化的LAMP-LFD可在65℃下60 min內(nèi)完成反應(yīng)，與其他方法比較發(fā)現(xiàn)LAMP-LFD可以應(yīng)用于FAdV-4的診斷，特別是在資源有限的地區(qū)。

3.2.2 鴨瘟病毒的檢測(cè) 鴨瘟病毒(DPV)引起多種禽類(lèi)的一種急性、熱性、敗血性傳染病，該病流行廣泛，發(fā)病率和死亡率高[17]。馬麗麗等[18]設(shè)計(jì)3對(duì)LAMP特異性引物擴(kuò)增DPV UL6保守序列，靈敏性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本方法可檢測(cè)0.1fg核酸，對(duì)其他病原體檢測(cè)均為陰性，優(yōu)化試驗(yàn)得出該體系在水浴鍋中1h內(nèi)即可完成反應(yīng)。張坤等[19]人根據(jù)DPV基因組序列，設(shè)計(jì)3對(duì)LAMP特異性引物，優(yōu)化篩選發(fā)現(xiàn)該引物在63℃恒溫反應(yīng)1h即可實(shí)現(xiàn)目的核酸的鑒定，此外，該檢測(cè)方法可在反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBRGreenI染料即可實(shí)現(xiàn)眼觀(guān)判斷，該方法敏感性可達(dá)0.245μg/L，高于普通PCR近10倍，對(duì)其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)40份臨床樣品陽(yáng)性檢出率高達(dá)30%。本方法檢測(cè)手段簡(jiǎn)便快捷，適用于基層實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確檢測(cè)DPV。

3.2.3 番鴨細(xì)小病毒的檢測(cè) 番鴨細(xì)小病毒(MPV)可引起3周齡內(nèi)雛番鴨腹瀉等，病死率可達(dá)40%~50%以上，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)中危害最嚴(yán)重的傳染病之一[20]。孟婷等[21]根據(jù)GenBank中公布的MDPVVP3保守序列設(shè)計(jì)LAMP特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，最終確定該方法在63℃恒溫反應(yīng)1h即可完成高效反應(yīng)，此外該方法針對(duì)核酸的最低檢測(cè)限為1×10-2ng/μl，且與其他病原微生物不發(fā)生反應(yīng)。該方法的建立為研制番鴨細(xì)小病毒的LAMP快速檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

3.3 家禽RNA病毒性腹瀉疾病檢測(cè)

3.3.1 新城疫病毒的檢測(cè) 新城疫(ND)是我國(guó)重點(diǎn)防控的重大動(dòng)物疾病之一，針對(duì)此類(lèi)病毒已經(jīng)建立多種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，但是依然存在耗能大，耗時(shí)長(zhǎng)，需要昂貴設(shè)備及專(zhuān)業(yè)人員操作等諸多弊端，限制在基層部門(mén)的推廣。鄭鳴等[22]針對(duì)AIV HA基因和NDV F基因設(shè)計(jì)特異性探針，建立了AIV和NDV雙重環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)方法，該方法特異性高，對(duì)AIV和NDV核酸樣品檢測(cè)的最低極限質(zhì)量濃度分別為25.0，12.5μg/L。錢(qián)科等[23]選取NDV融合蛋白基因(F 基因)設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，對(duì)甜菜堿濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度等LAMP反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)條件及特異性、敏感性等進(jìn)行研究，建立了一種特異性檢測(cè)NDV的LAMP方法，該方法最低能檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)的病毒核酸，且向反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ可直接觀(guān)察樣品是否含有NDV。

3.3.2 禽流感病毒的檢測(cè) 禽流感(AI)是近幾年來(lái)危害家禽健康的重要疾病，針對(duì)該病毒的檢測(cè)主要有常規(guī)PCR、血凝血抑實(shí)驗(yàn)，耗時(shí)較長(zhǎng)。黃書(shū)林等[24]針對(duì)H5亞型HA基因8個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了3對(duì)擴(kuò)增引物，在63℃反應(yīng)1h，可檢出102拷貝的目的基因，比RT-PCR方法敏感約10倍。另外對(duì)AIV、NDV和傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)為陰性。臨床驗(yàn)證表明RT-LAMP方法陽(yáng)性檢出率高于RT-PCR方法。Nakauchi等[25]利用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)禽流感A(H7N9)病毒，測(cè)定顯示其他亞型流感病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)性；靈敏度試驗(yàn)驗(yàn)證RT-LAMP可測(cè)定42.47拷貝數(shù)；該檢測(cè)方法具有高特異性和靈敏度，是一種很有應(yīng)用前景的禽流感A(H7N9)病毒快速診斷工具。

3.3.3 鴨坦布蘇病毒的檢測(cè) 鴨坦布蘇病毒病(DTMUVD)致蛋鴨產(chǎn)蛋率大幅下降，該病較易誤診，因此建立快速高效檢測(cè)方法尤為重要。Tank等[26]針對(duì)DTMUV NSS基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，并在反應(yīng)體系添加尿嘧啶DNA糖基化酶，建立了UDC-rRT-LAMP檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)81份臨床樣品進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UDC-rRT-LAMP方法和RT-PCR方法的一致性達(dá)到96.88%。吳植等[27]根據(jù)GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列設(shè)計(jì)了1套引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)，建立了RT-LAMP擴(kuò)增方法。結(jié)果顯示，該方法靈敏度是常規(guī)RT-PCR100倍，對(duì)其他常見(jiàn)禽源病毒無(wú)特異性擴(kuò)增。

4 LAMP技術(shù)改進(jìn)與優(yōu)化

目前，LAMP已經(jīng)成功用于臨床檢測(cè)，為進(jìn)一步提高檢測(cè)技術(shù)的靈敏及準(zhǔn)確度，仍需對(duì)LAMP技術(shù)進(jìn)行完善更新。以L(fǎng)AMP為基礎(chǔ)的多項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)被大量開(kāi)發(fā)。

4.1 多重LAMP

與普通多重PCR相似，多重LAMP針對(duì)多個(gè)病原微生物設(shè)計(jì)2/3對(duì)特異性引物，以達(dá)到一次擴(kuò)增反應(yīng)即可同時(shí)鑒定出多重病原微生物的目的，大大提高病檢效率。Stratakos等[28]成功設(shè)計(jì)針對(duì)非致病性與毒素大腸桿菌多重LAMP引物，特異性結(jié)果顯示良好。Rui等[29]針對(duì)四種按蚊和兩種瘧原蟲(chóng)保守基因，通過(guò)新開(kāi)發(fā)的DNA提取方法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的制備，同時(shí)建立多重LAMP方法，該方法靈敏度大于95%，特異性達(dá)100%。

4.2 橫向流動(dòng)試紙條

2008年Kiatpathomchai[30]首次將橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)與LAMP技術(shù)結(jié)合(LAMP-LFD)，用于病原快速檢測(cè)。反應(yīng)中，F(xiàn)ITC標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物，并結(jié)合在橫向流動(dòng)試紙條具有生物素抗體的檢測(cè)線(xiàn)上，未雜交的FITC標(biāo)記探針與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)，結(jié)合在控制線(xiàn)上。最后通過(guò)檢測(cè)帶即可判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)。目前該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于弓形蟲(chóng)[31]，沙門(mén)氏菌[32]等，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)安全、快速、高效、無(wú)需設(shè)備及檢測(cè)人員技術(shù)限制，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.3 LAMP-ELISA

將LAMP與ELISA技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的差異，反應(yīng)擴(kuò)增目的基因的數(shù)值，該方法可增強(qiáng)擴(kuò)增結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確性。Lee[33]等將LAMP與ELISA聯(lián)合檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌分離株的多藥耐藥性。該方法對(duì)靶抗藥基因熱點(diǎn)區(qū)域的點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)引物，采用LAMP、雜交和熱熔法鑒別同源雙鏈DNA(藥物敏感染色體)和異源雙鏈DNA(抗體突變體)。以ELISA比色檢測(cè)，在藥物敏感菌株中產(chǎn)生顏色變化。該LAMP-PCR-雜交-熱熔-ELISA(LAMP-TM-ELISA)方法與自動(dòng)BACTEC MGIT 960系統(tǒng)的比較顯示該分子分析對(duì)異煙肼，利福平，阿米卡星和環(huán)丙沙星耐藥性的敏感性，結(jié)核病分別為92.3%，95.3%，93.1%和91.4%。該方法對(duì)檢測(cè)人員的健康不構(gòu)成威脅，值得推廣應(yīng)用。

4.4 數(shù)字聯(lián)合技術(shù)

數(shù)字微流體是目前分子診斷領(lǐng)域新型平臺(tái)，與LAMP技術(shù)結(jié)合使該技術(shù)得到突破性發(fā)展[34]。夏赟[35]首先建立了一種半封閉式的微流控旋轉(zhuǎn)反應(yīng)芯片平臺(tái)，并將其成功應(yīng)用于可視化LAMP檢測(cè)中。隨后，基于泊松統(tǒng)計(jì)及化學(xué)計(jì)量學(xué)基本理論，建立了數(shù)字等溫?cái)U(kuò)增定量檢測(cè)方法的數(shù)學(xué)模型，利用科學(xué)計(jì)算與可視化工具對(duì)該模型進(jìn)行了蒙特卡洛模擬分析并驗(yàn)證了計(jì)算方法的有效及可靠性。該芯片方法能有效跨越4個(gè)數(shù)量級(jí)濃度的病原菌基因組進(jìn)行核酸定量分析，結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果一致。孔文等[36]整合LAMP和微流控芯片技術(shù)，建立微流控RT-LAMP快速檢測(cè)方法，針對(duì)甲型H1N1流感病毒的M基因序列中8個(gè)不同區(qū)段設(shè)計(jì)LAMP引物篩選出1套引物，所建立的檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果的熒光實(shí)時(shí)判讀，可在65℃ 30min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)限可達(dá)10copies/μl。

5 LAMP展望

LAMP是一項(xiàng)極具實(shí)用且高突破性的快速核酸診斷技術(shù)。相比于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，LAMP操作簡(jiǎn)單，便捷，不需要昂貴PCR儀，極大縮短檢測(cè)時(shí)間，適用于在條件有限地區(qū)的推廣應(yīng)用，LAMP方法已被成功用于細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等病原的分子生物學(xué)檢測(cè)和診斷。此外，以L(fǎng)AMP為基礎(chǔ)的多重LAMP技術(shù)、LAMP-ELISA、LAMP與數(shù)字核酸技術(shù)聯(lián)合、納米金-LAMP等不斷被開(kāi)發(fā)利用，針對(duì)LAMP檢測(cè)試劑盒也已經(jīng)用于出售及專(zhuān)利申請(qǐng)，為該技術(shù)的普及和推廣提供一定的技術(shù)支持，目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品化。但LAMP技術(shù)也存在假陽(yáng)性、引物要求高、結(jié)果判斷單一等不足，目前針對(duì)此類(lèi)缺陷，各研究學(xué)者正努力在不斷開(kāi)發(fā)新LAMP-LFD技術(shù)，Primer Explorer引物設(shè)計(jì)軟件等方面進(jìn)行突破。相信在未來(lái)，隨著科學(xué)研究的不斷深厚，LAMP檢測(cè)技術(shù)將會(huì)作為逐步滲入至基層養(yǎng)殖場(chǎng)，極具推廣應(yīng)用前景。

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（2019–09–24）

山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（SDPDI201808）

S858.3

B

1007-1733(2019)12-0092-05