難治性癲癇患兒腦組織srGAP2 γ-氨基丁酸及MCP-1表達(dá)的意義

劉 偉 呂秀麗 李戰(zhàn)華△

1)駐馬店市第一人民醫(yī)院兒科，河南 駐馬店 463000 2)駐馬店市中心醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)室，河南 駐馬店 463000

癲癇系無(wú)中樞神經(jīng)占位性疾病或系統(tǒng)進(jìn)行性疾病，其發(fā)作與多種病因密切相關(guān)[1-4]。小兒難治性癲癇患者一般每月至少發(fā)作4次以上[5-8]，治療后臨床病情反復(fù)，經(jīng)2 a以上正規(guī)抗癲癇治療后患者病情依舊無(wú)法達(dá)到有效控制[9-14]。小兒難治性癲癇預(yù)防和治療是臨床亟待解決的難題，是神經(jīng)病學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。難治性癲癇占癲癇的20%～30%。研究[4-6，15-18]顯示，srGAP2、γ-氨基丁酸以及MCP-1與小兒難治性癲癇存在一定聯(lián)系。本研究探討srGAP2、γ-氨基丁酸及MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)及意義。

1 資料和方法

1．1病例選擇從駐馬店市第一人民醫(yī)院難治性癲癇腦庫(kù)中選取11例患兒的顳葉腦組織。所有腦組織樣本是在難治性癲癇患兒手術(shù)治療中獲得。使用腦電圖定位判斷腦組織是否異常放電并切除異常放電的腦組織，使用電極檢測(cè)周?chē)M織是否切除干凈，使用Engel評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)治療效果。對(duì)照組11例顳葉標(biāo)本，為同期收治的由于外傷致頭顱損傷，進(jìn)行顱內(nèi)減壓手術(shù)等搶救治療無(wú)效的病例，依據(jù)法律規(guī)定嚴(yán)格按照程序取出顳葉腦組織。所有病例滿足以下條件：(1)無(wú)癲癇史；(2)既往無(wú)顱內(nèi)腫瘤以及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病；(3)取材部位均為顳葉組織；(4)病理切片結(jié)果表明腦組織正常；(5)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得家屬同意和簽署知情同意書(shū)。

1．2方法手術(shù)取材標(biāo)本分為2份，一部分立即放入液氮罐內(nèi)保存用于后續(xù)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，另外部分置于4%多聚甲醛，固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋用于后續(xù)免疫組化。使用免疫組化和免疫印跡等檢測(cè)srGAP2、γ-氨基丁酸以及MCP-1的表達(dá)含量。

2 結(jié)果

2．1 srGAP2在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況出現(xiàn)顆粒狀沉積或棕黃色點(diǎn)狀沉積為srGAP2的免疫反應(yīng)陽(yáng)性，在正常腦組織中srGAP2的表達(dá)較弱，srGAP2主要集中在神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中表達(dá)(圖1A、1B)。難治性癲癇患兒腦組織中srGAP2的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(圖1C、1D)。難治性癲癇患兒腦組織為0.657±0.206，正常腦組織中srGAP2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/1 000個(gè)細(xì)胞為0.192±0.100(P=0.006 57) 。

蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，正常腦組織中srGAP2的表達(dá)較弱，難治性癲癇患兒腦組織中srGAP2的表達(dá)較強(qiáng)。正常腦組織srGAP2的相對(duì)表達(dá)量0.593±0.170，難治性癲癇患兒腦組織為1.447±0.220(P=0.022 0)。見(jiàn)圖2。

圖1 srGAP2在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況(免疫組化試驗(yàn)，Bar=50 μm)Figure 1 Expression of srGAP2 in brain tissue of children with refractory epilepsy (immunohistochemistry experiment，Bra = 50 μm)

圖2 srGAP2在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況(蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn))Figure 2 Expression of srGAP2 in brain tissue of children with refractory epilepsy

2．2 γ-氨基丁酸在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況難治性癲癇患兒腦組織和正常腦組織均可見(jiàn)染成棕褐色的神經(jīng)元，難治性癲癇患兒腦組織中和正常腦組織中均有γ-氨基丁酸能神經(jīng)元表達(dá)，但難治性癲癇患兒腦組織γ-氨基丁酸能神經(jīng)元表達(dá)量明顯低于正常腦組織。難治性癲癇患兒陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(106.07±27.33)個(gè)，正常腦組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(178.44±28.80)個(gè)，2組腦組織的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010 8)。

2．3 MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況陰性對(duì)照組無(wú)MCP-1的表達(dá)(圖3A)，陽(yáng)性對(duì)照組MCP-1的表達(dá)顯著(圖3B)，正常腦組織中海馬和顳葉MCP-1的表達(dá)陰性(圖3C、4D)，難治性癲癇患兒腦組織海馬和顳葉MCP-1的表達(dá)陽(yáng)性(圖3E、4F)。

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常腦組織中MCP-1的表達(dá)較弱，難治性癲癇患兒腦組織中MCP-1的表達(dá)較強(qiáng)。正常腦組織srGAP2的相對(duì)表達(dá)量0.239±0.075 4，難治性癲癇患兒腦組織srGAP2的相對(duì)表達(dá)量1.979±0.372(P=0.003 62)。見(jiàn)圖4。

3 討論

研究表明，正常人腦組織在皮質(zhì)中有少量srGAP2表達(dá)，主要位于神經(jīng)細(xì)胞的胞漿以及胞膜部分，srGAP2可以抑制神經(jīng)細(xì)胞遷移，參與苔蘚纖維出芽過(guò)程誘導(dǎo)局部纖維環(huán)路生成[7，19-25]。在難治性癲癇患兒腦組織中srGAP2的表達(dá)量顯著高于正常人，降低srGAP2 的表達(dá)則可以有效降低軸突和樹(shù)突分支的數(shù)量[8，26-31]。srGAP2誘導(dǎo)絲狀偽足形成，進(jìn)而調(diào)解突觸的生長(zhǎng)，與其他導(dǎo)向因子共同作用破壞正確的神經(jīng)聯(lián)系，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)異常，進(jìn)而可能引發(fā)癲癇[9-10，32-36]。

γ-氨基丁酸與癲癇的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系。作為腦組織重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，γ-氨基丁酸與近50%中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的功能相關(guān)[11，37-42]。γ-氨基丁酸介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞作用的下降是導(dǎo)致癲癇發(fā)生過(guò)程中神經(jīng)元過(guò)興奮性的一個(gè)重要因素，可以推測(cè)γ-氨基丁酸神經(jīng)元的受損與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)，癲癇的發(fā)生與γ-氨基丁酸神經(jīng)元的數(shù)量存在密切聯(lián)系[12-15，43-47]。研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸受體主要位于中樞部位，包含GABAB、GABAA及GABAC三種受體，GABAA受體是影響意義最大的一種[16-17，48-53]。GABAA受體位于中樞突觸后膜，與后膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合，通過(guò)動(dòng)作電位使細(xì)胞膜內(nèi)電位增加而出現(xiàn)超極化現(xiàn)象，形成早期抑制性突觸后電位，可能在癲癇的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[18]。

MCP-1作為一種細(xì)胞趨化因子，最早由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤株分離得到。MCP-1 在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用[19-21，33]：(1)通過(guò)活化小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)神經(jīng)炎性反應(yīng)；(2)誘導(dǎo)粒細(xì)胞的滲透，粒細(xì)胞在腦組織可以介導(dǎo)炎性反應(yīng)，進(jìn)而加重血腦屏障的滲漏；(3)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞以及神經(jīng)前體細(xì)胞的趨化遷移，對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行有效修復(fù)；(4)作為重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，借助于突觸前機(jī)制增加神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)突觸的傳遞。

圖3 MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況(免疫組化試驗(yàn)，×400)Figure 3 Expression of MCP-1 in brain tissue of children with refractory epilepsy (immunohistochemistry experiment，×400)

圖4 MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況(蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn))Figure 4 Expression of MCP-1 in brain tissue of children with intractable epilepsy

本研究顯示，難治性癲癇患兒腦組織srGAP2的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常腦組織。難治性癲癇患兒腦組織和正常腦組織中均有γ-氨基丁酸能神經(jīng)元表達(dá)，但難治性癲癇患兒腦組織γ-氨基丁酸能神經(jīng)元表達(dá)量明顯低于正常腦組織。正常腦組織中MCP-1的表達(dá)較弱，難治性癲癇患兒腦組織中MCP-1的表達(dá)較強(qiáng)。srGAP2、γ-氨基丁酸及MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達(dá)情況與文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道一致。