難治性癲癇患兒腦組織srGAP2 γ-氨基丁酸及MCP-1表達的意義

劉 偉 呂秀麗 李戰華△

1)駐馬店市第一人民醫院兒科，河南 駐馬店 463000 2)駐馬店市中心醫院新生兒重癥監護室，河南 駐馬店 463000

癲癇系無中樞神經占位性疾病或系統進行性疾病，其發作與多種病因密切相關[1-4]。小兒難治性癲癇患者一般每月至少發作4次以上[5-8]，治療后臨床病情反復，經2 a以上正規抗癲癇治療后患者病情依舊無法達到有效控制[9-14]。小兒難治性癲癇預防和治療是臨床亟待解決的難題，是神經病學研究的難點和熱點。難治性癲癇占癲癇的20%～30%。研究[4-6，15-18]顯示，srGAP2、γ-氨基丁酸以及MCP-1與小兒難治性癲癇存在一定聯系。本研究探討srGAP2、γ-氨基丁酸及MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達及意義。

1 資料和方法

1．1病例選擇從駐馬店市第一人民醫院難治性癲癇腦庫中選取11例患兒的顳葉腦組織。所有腦組織樣本是在難治性癲癇患兒手術治療中獲得。使用腦電圖定位判斷腦組織是否異常放電并切除異常放電的腦組織，使用電極檢測周圍組織是否切除干凈，使用Engel評分標準評價治療效果。對照組11例顳葉標本，為同期收治的由于外傷致頭顱損傷，進行顱內減壓手術等搶救治療無效的病例，依據法律規定嚴格按照程序取出顳葉腦組織。所有病例滿足以下條件：(1)無癲癇史；(2)既往無顱內腫瘤以及其他神經系統疾病；(3)取材部位均為顳葉組織；(4)病理切片結果表明腦組織正常；(5)獲得我院倫理委員會批準并征得家屬同意和簽署知情同意書。

1．2方法手術取材標本分為2份，一部分立即放入液氮罐內保存用于后續蛋白免疫印跡實驗，另外部分置于4%多聚甲醛，固定48 h后進行石蠟包埋用于后續免疫組化。使用免疫組化和免疫印跡等檢測srGAP2、γ-氨基丁酸以及MCP-1的表達含量。

2 結果

2．1 srGAP2在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況出現顆粒狀沉積或棕黃色點狀沉積為srGAP2的免疫反應陽性，在正常腦組織中srGAP2的表達較弱，srGAP2主要集中在神經細胞的細胞漿和細胞膜中表達(圖1A、1B)。難治性癲癇患兒腦組織中srGAP2的陽性表達率顯著高于對照組(圖1C、1D)。難治性癲癇患兒腦組織為0.657±0.206，正常腦組織中srGAP2的陽性細胞數/1 000個細胞為0.192±0.100(P=0.006 57) 。

蛋白質免疫印跡試驗結果顯示，正常腦組織中srGAP2的表達較弱，難治性癲癇患兒腦組織中srGAP2的表達較強。正常腦組織srGAP2的相對表達量0.593±0.170，難治性癲癇患兒腦組織為1.447±0.220(P=0.022 0)。見圖2。

圖1 srGAP2在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況(免疫組化試驗，Bar=50 μm)Figure 1 Expression of srGAP2 in brain tissue of children with refractory epilepsy (immunohistochemistry experiment，Bra = 50 μm)

圖2 srGAP2在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況(蛋白質免疫印跡試驗)Figure 2 Expression of srGAP2 in brain tissue of children with refractory epilepsy

2．2 γ-氨基丁酸在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況難治性癲癇患兒腦組織和正常腦組織均可見染成棕褐色的神經元，難治性癲癇患兒腦組織中和正常腦組織中均有γ-氨基丁酸能神經元表達，但難治性癲癇患兒腦組織γ-氨基丁酸能神經元表達量明顯低于正常腦組織。難治性癲癇患兒陽性細胞數(106.07±27.33)個，正常腦組織陽性細胞數(178.44±28.80)個，2組腦組織的表達比較差異有統計學意義(P=0.010 8)。

2．3 MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況陰性對照組無MCP-1的表達(圖3A)，陽性對照組MCP-1的表達顯著(圖3B)，正常腦組織中海馬和顳葉MCP-1的表達陰性(圖3C、4D)，難治性癲癇患兒腦組織海馬和顳葉MCP-1的表達陽性(圖3E、4F)。

蛋白質免疫印跡實驗結果顯示，正常腦組織中MCP-1的表達較弱，難治性癲癇患兒腦組織中MCP-1的表達較強。正常腦組織srGAP2的相對表達量0.239±0.075 4，難治性癲癇患兒腦組織srGAP2的相對表達量1.979±0.372(P=0.003 62)。見圖4。

3 討論

研究表明，正常人腦組織在皮質中有少量srGAP2表達，主要位于神經細胞的胞漿以及胞膜部分，srGAP2可以抑制神經細胞遷移，參與苔蘚纖維出芽過程誘導局部纖維環路生成[7，19-25]。在難治性癲癇患兒腦組織中srGAP2的表達量顯著高于正常人，降低srGAP2 的表達則可以有效降低軸突和樹突分支的數量[8，26-31]。srGAP2誘導絲狀偽足形成，進而調解突觸的生長，與其他導向因子共同作用破壞正確的神經聯系，神經網絡出現異常，進而可能引發癲癇[9-10，32-36]。

γ-氨基丁酸與癲癇的發生和發展有密切的關系。作為腦組織重要的抑制性神經遞質，γ-氨基丁酸與近50%中樞神經系統神經元的功能相關[11，37-42]。γ-氨基丁酸介導的抑制性突觸傳遞作用的下降是導致癲癇發生過程中神經元過興奮性的一個重要因素，可以推測γ-氨基丁酸神經元的受損與中樞神經系統功能密切相關，癲癇的發生與γ-氨基丁酸神經元的數量存在密切聯系[12-15，43-47]。研究發現，γ-氨基丁酸受體主要位于中樞部位，包含GABAB、GABAA及GABAC三種受體，GABAA受體是影響意義最大的一種[16-17，48-53]。GABAA受體位于中樞突觸后膜，與后膜上相應的抗體結合，通過動作電位使細胞膜內電位增加而出現超極化現象，形成早期抑制性突觸后電位，可能在癲癇的發病機制中發揮重要作用[18]。

MCP-1作為一種細胞趨化因子，最早由神經膠質細胞瘤株分離得到。MCP-1 在癲癇發作中發揮重要作用[19-21，33]：(1)通過活化小膠質細胞介導神經炎性反應；(2)誘導粒細胞的滲透，粒細胞在腦組織可以介導炎性反應，進而加重血腦屏障的滲漏；(3)促進神經干細胞以及神經前體細胞的趨化遷移，對神經元進行有效修復；(4)作為重要的神經調質，借助于突觸前機制增加神經元的興奮性，促進突觸的傳遞。

圖3 MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況(免疫組化試驗，×400)Figure 3 Expression of MCP-1 in brain tissue of children with refractory epilepsy (immunohistochemistry experiment，×400)

圖4 MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況(蛋白質免疫印跡試驗)Figure 4 Expression of MCP-1 in brain tissue of children with intractable epilepsy

本研究顯示，難治性癲癇患兒腦組織srGAP2的陽性表達率顯著高于正常腦組織。難治性癲癇患兒腦組織和正常腦組織中均有γ-氨基丁酸能神經元表達，但難治性癲癇患兒腦組織γ-氨基丁酸能神經元表達量明顯低于正常腦組織。正常腦組織中MCP-1的表達較弱，難治性癲癇患兒腦組織中MCP-1的表達較強。srGAP2、γ-氨基丁酸及MCP-1在難治性癲癇患兒腦組織中的表達情況與文獻[22-23]報道一致。