膠質母細胞瘤干細胞成球培養與患者預后的相關性研究

宋振宇 馬斯奇 羅文正 吳力新

鄭州大學第一附屬醫院神經外科，河南 鄭州 450052

膠質母細胞瘤的腫瘤干細胞理論認為在腫瘤細胞中存在一小群具有干細胞特性的細胞，具有真正形成膠質母細胞瘤的能力，被稱為膠質瘤干細胞[1-3]。膠質瘤干細胞在體外培養條件下能夠自我更新并形成腫瘤球，在體內能夠形成腫瘤，臨床上被認為是腫瘤難以根治的根本原因[4-6]。但膠質瘤干細胞分裂產生的后代僅用于腫瘤的生長，其成克隆能力明顯降低。在此基礎上，研究者對腫瘤干細胞模型假說進行了重新審視，提出了更加新穎的觀點：腫瘤細胞可以被腫瘤所在微環境調節，使非干性的腫瘤細胞轉化成為腫瘤干細胞[7-9]。盡管如此，腫瘤干細胞理論仍然為腫瘤的治療抗性和復發性提供了理論基礎，部分腫瘤中的干細胞也作為主要的治療靶點對患者進行有效的治療干預。

雖然對腫瘤干細胞的研究為人們充分理解膠質瘤的生物學特性提供了巨大的幫助，但到目前為止，這些研究結果對臨床的轉化應用卻相當有限。研究發現，在干細胞培養條件下，膠質母細胞瘤細胞形成漂浮的腫瘤球的能力預示著患者較差的預后[8-9]。一些體內和體外實驗證明膠質瘤干細胞對于現行的治療手段具有很強的抗性，包括放療和TMZ化療[10]。但最近的研究指出，不論是在放療后富集了腫瘤干細胞的膠質瘤樣本[11]，還是在患者原代腫瘤或復發的腫瘤樣本中[12]，膠質瘤細胞的干性與患者的預后關系遠比想象中復雜。確定GSC對放療和TMZ化療的抗性與臨床療效之間的關系對于確定分析GSC作為膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)治療效果預測的適用性和臨床相關性至關重要[13]。本文通過研究部分膠質瘤患者樣本體外培養形成的腫瘤球、放療及TMZ化療抗性和患者生存率之間的關系，以確定腫瘤球的特性是否能夠作為一種可靠的預測治療效果的工具，為現行或將來的個性化治療策略提供幫助。

1 資料與方法

1．1一般資料選取手術切除的新鮮膠質瘤樣本41例，其中男23例，女18例，年齡23～68歲。樣本去除血、壞死等部分，進行后續實驗。

1．2方法(1)腫瘤細胞成球培養：腫瘤組織經過解離，消化成單細胞后，接種于無血清培養基中(DMEM/F12，加入終濃度為20 ng/mL的FGF和10 ng/mL的EGF)，置于細胞培養箱中培養。隔天換液，每天觀察腫瘤細胞的生長和成球情況。(2)腫瘤球的放療和TMZ處理：腫瘤球以2.5×104個/mL的密度接種在合適的孔板中，放療腫瘤球以0.8 Gy/min的劑量接受總劑量為1～60 Gy的梯度照射后，培養7 d進行細胞活性的測定；TMZ化療的腫瘤球，將TMZ在3.9 μmol/L～1 mmol/L的濃度范圍稀釋成不同的濃度梯度后，處理腫瘤球細胞24 h后，進行細胞活性的測定。

2 結果

2．1腫瘤球的培養及與臨床病理特征的關系對41例患者的膠質瘤樣本進行體外培養，其中20例能夠成功形成腫瘤球，成球時間2～21周。腫瘤細胞能夠成球的膠質瘤患者與不能成球患者的年齡、性別、癥狀持續時間和病灶部位無明顯區別，但能夠成球的膠質瘤患者的中位生存期和PFS明顯低于不能成球的患者(圖1)。除整個樣本隊列，在排除復發性腫瘤或未完成治療方案的復發性腫瘤病例后，腫瘤球的形成率與患者的生存率具有明顯的比例關系。

2．2腫瘤球對于放療的敏感性及預后關系對腫瘤球進行1～60 Gy劑量的放射處理，在該劑量范圍內，能夠反映出腫瘤球細胞的半數致死量(LD50)。整體來說，腫瘤球對于單一劑量的放射具有較強的抗性，25%的腫瘤球LD50>50 Gy，約等于患者分次放療劑量的總和。腫瘤球對于放療的敏感性與患者的總生存期無一定聯系，當以放射劑量12 Gy為截斷值時，LD50>該劑量的腫瘤球具有相對較低的PFS(圖2)。

2．3腫瘤球對于TMZ的敏感性及預后關系采用3.9 μmol/L～1 mmol/L的TMZ處理腫瘤球，腫瘤球對于TMZ具有很強的抗性，20%的腫瘤球的TMZ IC50值>1 mmol/L。腫瘤球對于TMZ的敏感性與患者的生存期有直接的關系。將180 μmol/L設定為截斷值，該濃度是患者化療時血漿濃度的3倍。通過分析發現，IC50>180 μmol/L的腫瘤球來源患者具有較短的OS和PFS(圖3)。

3 討論

本研究證明了腫瘤球形成及其相關特性與膠質瘤患者預后之間的關系，實驗發現腫瘤球的形成率與患者預后之間的具有直接的相關性，而與患者的年齡、性別、術后KPS以及術后放化療的完成情況無直接關聯[14-17]。

本文關注的問題是腫瘤細胞成球率及腫瘤球特性是否可以直接轉化為預測治療結果，但有兩個問題限制了這種轉化率。第一是技術方面的限制，本研究只能從1/2的膠質瘤樣本中培養出腫瘤球，雖然一些特殊的培養條件能夠提高成球率，如低氧環境或盡可能去除細胞碎片[18-20]，但仍然有很多膠質瘤樣本不能形成腫瘤球，提示通過分析腫瘤球的性質預測患者的生存期適用范圍有限[21-26]。第二涉及到腫瘤球的臨床相關性與腫瘤細胞異質性的問題[27-30]。膠質瘤是具有異質性的實體腫瘤。最近對膠質瘤進行單細胞的RNA測序顯示每個腫瘤樣本都具有極強的異質性[31-35]。膠質瘤極強的異質性促使研究者們提出了這樣一個假說，不同的細胞群可能形成不同性質的腫瘤球，每一類都有自己的致癌途徑。但有研究指出，在分離的膠質瘤樣本中，腫瘤干細胞轉錄水平的多樣性明顯低于其來源的膠質瘤細胞的多樣性[36-44]，提示與腫瘤相關的信號通路的變化很可能發生在分化程度較高的腫瘤細胞中。本實驗也發現來自同一個膠質瘤樣本不同區域細胞形成的4例腫瘤球具有十分類似的放化療抗性，進一步證明具有干細胞特性的腫瘤細胞具有相對均一性[45-51]。

圖1 膠質瘤細胞是否形成腫瘤球與患者生存期的關系 A：能夠成球與不能成球組織來源患者的總生存期；B：能夠成球與不能成球組織來源患者的無進展生存期Figure 1 The relationship between whether glioma cells form tumor globules and patient survival A：Total survival of patients who can and can't form globular tissue；B：Progressive survival of patients who can and can't form globular tissue

圖2 膠質瘤腫瘤球對于放療的敏感性及相應患者的生存期 A：不同患者來源的膠質瘤細胞形成的腫瘤球對于放療劑量的LD50值；B：以LD50=12 Gy為截斷值分析患者的總生存期差異；C：以LD50=12 Gy為截斷值分析患者的無進展生存期差異Figure 2 Sensitivity of glioma spheres to radiotherapy and survival time of corresponding patients A：LD50 value of glioma spheres formed by glioma cells from different patients for radiation dose；B：LD50=12 Gy as truncation value to analyze the difference of total survival time of patients；C：LD50=12 Gy as truncation value to analyze the difference of progression-free survival time of patients

圖3 膠質瘤腫瘤球對于TMZ的敏感性及相應患者的生存期 A：不同患者來源的膠質瘤細胞形成的腫瘤球對于TMZ劑量的IC50值；B：以IC50=180 μmol/L為截斷值分析患者的總生存期差異；C：以LD50=180 μmol/L為截斷值分析患者的無進展生存期差異Figure 3 Sensitivity of glioma tumour spheres to TMZ and survival time of corresponding patients A：IC50 value of TMZ dosage for glioma spheres formed by glioma cells from different patients；B：IC50=180 μmol/L as truncation value to analyze the difference of total survival time of patients；C：LD50=180 μmol/L as truncation value to analyze the difference of progression-free survival time of patients

本研究發現，當腫瘤球的放射LD50>12 Gy，TMZ處理劑量的IC50>180 μmol/L時，該腫瘤球來源的患者對于現行治療方案效果較差。大部分腫瘤球對于放化療有明顯的抗性，這可能是由于早期DNA檢查點被破環以及某些基因的的表達變化造成的[52-55]。此外，實驗中觀察到腫瘤球經過血清培養后對于TMZ的敏感性明顯降低，一方面可能是因血清能夠抑制腫瘤干細胞增殖而促進其分化，使其轉化為終末分化的腫瘤細胞造成的；另一方面，也可能是由于血清中含有大量的黏附及促生存因子導致的[56-61]。

本研究通過分析腫瘤細胞的成球能和放化療敏感性，以評估患者的腫瘤性質和生物學特性，為臨床制定更為有效的治療方案，選擇更為有效的藥物和合適的治療周期提供幫助。