膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞成球培養(yǎng)與患者預(yù)后的相關(guān)性研究

宋振宇 馬斯奇 羅文正 吳力新

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中存在一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，具有真正形成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的能力，被稱為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞[1-3]。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能夠自我更新并形成腫瘤球，在體內(nèi)能夠形成腫瘤，臨床上被認(rèn)為是腫瘤難以根治的根本原因[4-6]。但膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的后代僅用于腫瘤的生長，其成克隆能力明顯降低。在此基礎(chǔ)上，研究者對腫瘤干細(xì)胞模型假說進(jìn)行了重新審視，提出了更加新穎的觀點(diǎn)：腫瘤細(xì)胞可以被腫瘤所在微環(huán)境調(diào)節(jié)，使非干性的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為腫瘤干細(xì)胞[7-9]。盡管如此，腫瘤干細(xì)胞理論仍然為腫瘤的治療抗性和復(fù)發(fā)性提供了理論基礎(chǔ)，部分腫瘤中的干細(xì)胞也作為主要的治療靶點(diǎn)對患者進(jìn)行有效的治療干預(yù)。

雖然對腫瘤干細(xì)胞的研究為人們充分理解膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性提供了巨大的幫助，但到目前為止，這些研究結(jié)果對臨床的轉(zhuǎn)化應(yīng)用卻相當(dāng)有限。研究發(fā)現(xiàn)，在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞形成漂浮的腫瘤球的能力預(yù)示著患者較差的預(yù)后[8-9]。一些體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對于現(xiàn)行的治療手段具有很強(qiáng)的抗性，包括放療和TMZ化療[10]。但最近的研究指出，不論是在放療后富集了腫瘤干細(xì)胞的膠質(zhì)瘤樣本[11]，還是在患者原代腫瘤或復(fù)發(fā)的腫瘤樣本中[12]，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干性與患者的預(yù)后關(guān)系遠(yuǎn)比想象中復(fù)雜。確定GSC對放療和TMZ化療的抗性與臨床療效之間的關(guān)系對于確定分析GSC作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)治療效果預(yù)測的適用性和臨床相關(guān)性至關(guān)重要[13]。本文通過研究部分膠質(zhì)瘤患者樣本體外培養(yǎng)形成的腫瘤球、放療及TMZ化療抗性和患者生存率之間的關(guān)系，以確定腫瘤球的特性是否能夠作為一種可靠的預(yù)測治療效果的工具，為現(xiàn)行或?qū)淼膫€(gè)性化治療策略提供幫助。

1 資料與方法

1．1一般資料選取手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤樣本41例，其中男23例，女18例，年齡23～68歲。樣本去除血、壞死等部分，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．2方法(1)腫瘤細(xì)胞成球培養(yǎng)：腫瘤組織經(jīng)過解離，消化成單細(xì)胞后，接種于無血清培養(yǎng)基中(DMEM/F12，加入終濃度為20 ng/mL的FGF和10 ng/mL的EGF)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，每天觀察腫瘤細(xì)胞的生長和成球情況。(2)腫瘤球的放療和TMZ處理：腫瘤球以2.5×104個(gè)/mL的密度接種在合適的孔板中，放療腫瘤球以0.8 Gy/min的劑量接受總劑量為1～60 Gy的梯度照射后，培養(yǎng)7 d進(jìn)行細(xì)胞活性的測定；TMZ化療的腫瘤球，將TMZ在3.9 μmol/L～1 mmol/L的濃度范圍稀釋成不同的濃度梯度后，處理腫瘤球細(xì)胞24 h后，進(jìn)行細(xì)胞活性的測定。

2 結(jié)果

2．1腫瘤球的培養(yǎng)及與臨床病理特征的關(guān)系對41例患者的膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行體外培養(yǎng)，其中20例能夠成功形成腫瘤球，成球時(shí)間2～21周。腫瘤細(xì)胞能夠成球的膠質(zhì)瘤患者與不能成球患者的年齡、性別、癥狀持續(xù)時(shí)間和病灶部位無明顯區(qū)別，但能夠成球的膠質(zhì)瘤患者的中位生存期和PFS明顯低于不能成球的患者(圖1)。除整個(gè)樣本隊(duì)列，在排除復(fù)發(fā)性腫瘤或未完成治療方案的復(fù)發(fā)性腫瘤病例后，腫瘤球的形成率與患者的生存率具有明顯的比例關(guān)系。

2．2腫瘤球?qū)τ诜暖煹拿舾行约邦A(yù)后關(guān)系對腫瘤球進(jìn)行1～60 Gy劑量的放射處理，在該劑量范圍內(nèi)，能夠反映出腫瘤球細(xì)胞的半數(shù)致死量(LD50)。整體來說，腫瘤球?qū)τ趩我粍┝康姆派渚哂休^強(qiáng)的抗性，25%的腫瘤球LD50>50 Gy，約等于患者分次放療劑量的總和。腫瘤球?qū)τ诜暖煹拿舾行耘c患者的總生存期無一定聯(lián)系，當(dāng)以放射劑量12 Gy為截?cái)嘀禃r(shí)，LD50>該劑量的腫瘤球具有相對較低的PFS(圖2)。

2．3腫瘤球?qū)τ赥MZ的敏感性及預(yù)后關(guān)系采用3.9 μmol/L～1 mmol/L的TMZ處理腫瘤球，腫瘤球?qū)τ赥MZ具有很強(qiáng)的抗性，20%的腫瘤球的TMZ IC50值>1 mmol/L。腫瘤球?qū)τ赥MZ的敏感性與患者的生存期有直接的關(guān)系。將180 μmol/L設(shè)定為截?cái)嘀担摑舛仁腔颊呋煏r(shí)血漿濃度的3倍。通過分析發(fā)現(xiàn)，IC50>180 μmol/L的腫瘤球來源患者具有較短的OS和PFS(圖3)。

3 討論

本研究證明了腫瘤球形成及其相關(guān)特性與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤球的形成率與患者預(yù)后之間的具有直接的相關(guān)性，而與患者的年齡、性別、術(shù)后KPS以及術(shù)后放化療的完成情況無直接關(guān)聯(lián)[14-17]。

本文關(guān)注的問題是腫瘤細(xì)胞成球率及腫瘤球特性是否可以直接轉(zhuǎn)化為預(yù)測治療結(jié)果，但有兩個(gè)問題限制了這種轉(zhuǎn)化率。第一是技術(shù)方面的限制，本研究只能從1/2的膠質(zhì)瘤樣本中培養(yǎng)出腫瘤球，雖然一些特殊的培養(yǎng)條件能夠提高成球率，如低氧環(huán)境或盡可能去除細(xì)胞碎片[18-20]，但仍然有很多膠質(zhì)瘤樣本不能形成腫瘤球，提示通過分析腫瘤球的性質(zhì)預(yù)測患者的生存期適用范圍有限[21-26]。第二涉及到腫瘤球的臨床相關(guān)性與腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的問題[27-30]。膠質(zhì)瘤是具有異質(zhì)性的實(shí)體腫瘤。最近對膠質(zhì)瘤進(jìn)行單細(xì)胞的RNA測序顯示每個(gè)腫瘤樣本都具有極強(qiáng)的異質(zhì)性[31-35]。膠質(zhì)瘤極強(qiáng)的異質(zhì)性促使研究者們提出了這樣一個(gè)假說，不同的細(xì)胞群可能形成不同性質(zhì)的腫瘤球，每一類都有自己的致癌途徑。但有研究指出，在分離的膠質(zhì)瘤樣本中，腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的多樣性明顯低于其來源的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的多樣性[36-44]，提示與腫瘤相關(guān)的信號通路的變化很可能發(fā)生在分化程度較高的腫瘤細(xì)胞中。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)來自同一個(gè)膠質(zhì)瘤樣本不同區(qū)域細(xì)胞形成的4例腫瘤球具有十分類似的放化療抗性，進(jìn)一步證明具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞具有相對均一性[45-51]。

圖1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞是否形成腫瘤球與患者生存期的關(guān)系 A：能夠成球與不能成球組織來源患者的總生存期；B：能夠成球與不能成球組織來源患者的無進(jìn)展生存期Figure 1 The relationship between whether glioma cells form tumor globules and patient survival A：Total survival of patients who can and can't form globular tissue；B：Progressive survival of patients who can and can't form globular tissue

圖2 膠質(zhì)瘤腫瘤球?qū)τ诜暖煹拿舾行约跋鄳?yīng)患者的生存期 A：不同患者來源的膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成的腫瘤球?qū)τ诜暖焺┝康腖D50值；B：以LD50=12 Gy為截?cái)嘀捣治龌颊叩目偵嫫诓町?；C：以LD50=12 Gy為截?cái)嘀捣治龌颊叩臒o進(jìn)展生存期差異Figure 2 Sensitivity of glioma spheres to radiotherapy and survival time of corresponding patients A：LD50 value of glioma spheres formed by glioma cells from different patients for radiation dose；B：LD50=12 Gy as truncation value to analyze the difference of total survival time of patients；C：LD50=12 Gy as truncation value to analyze the difference of progression-free survival time of patients

圖3 膠質(zhì)瘤腫瘤球?qū)τ赥MZ的敏感性及相應(yīng)患者的生存期 A：不同患者來源的膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成的腫瘤球?qū)τ赥MZ劑量的IC50值；B：以IC50=180 μmol/L為截?cái)嘀捣治龌颊叩目偵嫫诓町?；C：以LD50=180 μmol/L為截?cái)嘀捣治龌颊叩臒o進(jìn)展生存期差異Figure 3 Sensitivity of glioma tumour spheres to TMZ and survival time of corresponding patients A：IC50 value of TMZ dosage for glioma spheres formed by glioma cells from different patients；B：IC50=180 μmol/L as truncation value to analyze the difference of total survival time of patients；C：LD50=180 μmol/L as truncation value to analyze the difference of progression-free survival time of patients

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤球的放射LD50>12 Gy，TMZ處理劑量的IC50>180 μmol/L時(shí)，該腫瘤球來源的患者對于現(xiàn)行治療方案效果較差。大部分腫瘤球?qū)τ诜呕熡忻黠@的抗性，這可能是由于早期DNA檢查點(diǎn)被破環(huán)以及某些基因的的表達(dá)變化造成的[52-55]。此外，實(shí)驗(yàn)中觀察到腫瘤球經(jīng)過血清培養(yǎng)后對于TMZ的敏感性明顯降低，一方面可能是因血清能夠抑制腫瘤干細(xì)胞增殖而促進(jìn)其分化，使其轉(zhuǎn)化為終末分化的腫瘤細(xì)胞造成的；另一方面，也可能是由于血清中含有大量的黏附及促生存因子導(dǎo)致的[56-61]。

本研究通過分析腫瘤細(xì)胞的成球能和放化療敏感性，以評估患者的腫瘤性質(zhì)和生物學(xué)特性，為臨床制定更為有效的治療方案，選擇更為有效的藥物和合適的治療周期提供幫助。