miR-451在缺血性腦卒中表達的相關性研究

王蒙蒙 白 鷹△ 郎明非

1)大連大學附屬新華醫院，遼寧 大連 116021 2)大連大學醫學院，遼寧 大連 116622

腦卒中是導致死亡和嚴重的長期殘疾的主要原因[1-3]。目前，該病的診斷主要依賴于臨床癥狀和神經影像學技術[4-5]。然而在實際的臨床工作中仍存在一定的局限性，使得缺血性腦卒中在發病后沒有被識別。因此迫切需要提高缺血性腦卒中診斷的速度和準確性。通過外周血檢測生物指標，是一種無創或較小創傷的疾病診斷方法。此方法不僅可以快速的診斷疾病的發生，同時還可減輕病患疼痛[6-7]。與此同時，外泌體源性miRNA作為近年的研究熱點之一，在腦卒中相關方面的研究有了突破性的的進展。

外泌體最早在1983年被提出，PAN等[8-9]在紅細胞上清液的研究過程中發現囊狀小泡的存在。目前關于外泌體的認識更加深入，隨著機體病理生理的改變，外泌體中包含大量的、種類繁多的miRNA、mRNA、siRNA等生物活性物質也隨之發生相應的變化[10-11]。越來越多的實驗研究證明，外泌體源性miRNA多方面影響著腦血管以及神經系統的發生發展，在缺血性腦卒中的發生發展中發揮著重要的作用[12-13]。其中較為顯著的發現是，在疾病的發生發展過程中存在外泌體源性miRNA表達水平的特異性改變[14-16]。由此可見外泌體源性miRNA 作為生物標志物用于診斷和預后具有很大的潛能。因此本研究選取外泌體源性miR-451作為研究對象，探索其作為缺血性腦卒中臨床診斷標志物的可能性。

1 資料與方法

1．1一般資料收集2017-5—2018-05大連大學附屬新華醫院神經內科的缺血性腦卒中患者的血液標本30例，男14例，女16例。納入標準：(1)缺血性腦卒中的診斷符合2014 年中華醫學會缺血性腦血管病診療指南的標準；(2)患者發病24 h 內入院，且未行機械取栓或動靜脈溶栓治療。排除標準：(1)既往有腦卒中史；(2)合并嚴重心、肝、腎疾病及腫瘤等。本研究經過醫院倫理委員會同意，且參與者均簽署知情同意書。

1．2方法

1．2．1 血清中外泌體的分離：用miRNaeasy Serum/Plasma Kit(購于QIAGEN 公司)方法提取血清中的外泌體，通過Trizol(購于Takara 公司)的方法，裂解外泌體并提取其中全部的RNA，去除RNA 中的gDNA，以PrimeScriptTM RT reagent kit(購于Takara 公司)逆轉錄全部RNA 為cDNA。反應條件：42 ℃孵化15 min，85 ℃孵化5 s。

1．2．2 miR-451表達的檢測：通過SYBR 熒光(購于Takara 公司)實時定量PCR 技術，按照試劑盒說明書的反應體系，檢測血清外泌體中miR-451 的表達。采用兩步法的反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，共40 個循環；溶解曲線。CEL-39 作為內參對照。并使用2-△△Ct方法計算各組中miR-451 的表達量。

2 結果

2．1不同組間患者基本資料的比較患者的臨床基線特征，如年齡、性別、糖尿病、高血壓、高血脂等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2．2不同組間血清外泌體中miR-451表達比較相對于對照組，缺血性腦卒中患者發病后1 d與7 d組血清外泌體中miR-451的表達顯著升高，相對表達量分別為1.07±0.45，19.74±14.53，17.31±11.36。見圖1。

2．3血清外泌體中miR-451作為缺血性腦卒中臨床診斷標志物的價值ROC曲線分析結果顯示，缺血性腦卒中發病后1 d組血清外泌體中miR-451 AUC=1(P<0.001)，取相對表達值1為截斷點，靈敏度為100%，特異度為100%。缺血性腦卒中發病后7 d組，血清外泌體中miR-451 AUC=1(P<0.001)，取相對表達值1為截斷點，靈敏度為100%，特異度為100%。見圖2。

3 討論

腦卒中是我國第三大常見的死亡原因，也是世界范圍內最常見的致殘原因。而缺血性腦卒中是最常見類型[17-18]。其準確的臨床診斷一直是臨床醫生十分關注的問題。雖然當前關于缺血性腦卒中的醫學影像技術在不斷的發展，但因最新的成像技術操作復雜及費用高昂而在某種程度上未做到完全普及[19-21]。此外，影像學檢查對于區分陳舊性缺血灶和新發缺血灶存在著一定的局限性。相對而言，血液標志物檢測具有非創傷性、快速及經濟等優點，有希望通過尋找到有效的生物標志物，應用于各種疾病的診斷或預后判斷等。外泌體可廣泛的分布于人體各種體液中，在血液、尿液、唾液等均可被檢測[22]。外泌體在細胞間通訊中發揮重要作用，廣泛參與人體的各種生理和病理進展。缺血性腦卒中發生后，外泌體可以被合成并從腦卒中反應細胞中釋放出來，能夠通過血腦屏障，可以在外周血或腦脊液中檢測到，反映腦卒中病理進展[23]。此外，外泌體具有相對穩定的結構，可以保護其內容物免受破壞，因此可以通過檢測所攜帶的核酸、脂質、蛋白質等多種生物成分來判斷疾病的狀態，是一種可靠的潛在生物標志物[24-25]。實驗研究證明，外周血中的miRNA主要被包裹于外泌體中，可作為一項重要的觀察指標[26]。在缺血性腦卒中發生后，會有多種外泌體源性的miRNA發生變化，或上調或下調，其表達水平與疾病病理生理學相關[27-28]。然而針對缺血性腦卒中診斷的血液外泌體源性miRNA標志物尚不清楚。

在生物體中，DNA首先編碼生成pre-miRNA，經過一系列的酶切過程形成20nt左右的單鏈RNA即miRNA，與AGO結合形成有活性的RISC[29-30]。與mRNA的3’非編碼區(3’UTR)的2-8個堿基互補，成為種子區域，依據互補的完全性在翻譯過程分別引起mRNA降解或多肽鏈的脫落[31-33]。在針對腦卒中患者的研究中，據報道大概有超過20%的腦卒中存在miRNA的變化，因此研究者認識到miRNA與腦卒中之間有著緊密的聯系，進而開展了大量的實驗研究，并得到客觀的研究成果。

表1 2組基本資料比較Table 1 Comparison of basic data between two groups

注：A：缺血性腦卒中發病后1 d組外泌體源性miR-451的ROC曲線；B：缺血性腦卒中發病后7 d組外泌體源性miR-451的ROC曲線

通過創建腦卒中模型進行實驗發現，較假手術組，模型構建24 h后血清中的miR-124濃度升高150倍。可知腦卒中疾病發生后miR-124具有含量豐富的特點[34-35]。而且還有實驗表明，miR-124還有可能作為顱腦損傷嚴重程度分型的標志物[36-38]。所以，作為一種生物標記，miR-124有很大的研究價值。此外，經證實，不同的miRNA在腦卒中的發生發展過程中起著不同的功能作用。在缺血性腦提取物中發現，骨髓干細胞分泌的外泌體大量增加，攜帶的miR-133b被輸送到星形膠質細胞和神經元，增加軸突生長[39]；DA等[40]通過甲酚紫染色證明mir-122能明顯的減小腦卒中的梗死面積，以及改善小鼠的生物學行為；用去除膠實驗和錯步實驗來分析功能恢復情況，通過實驗組和對照組之間的比較發現miR-133b很大程度提高了神經恢復[41]。

關于miR-451的研究發現，其與缺血、神經系統疾病有著緊密的聯系。在低壓低氧的模型中，經證實血清中miR-451的表達明顯上調[42]。在心肌細胞缺血再灌注性損傷模型中，miR-451通過抑制HMGB1 mRNA增加心肌細胞的存活率、降低凋亡率[43-45]。與此同時，miR-451可通過下調Rac-1基因的表達，調節急性缺血引起的氧自由基的生成[46-47]。此外，在肺缺血再灌注模型中，miR-451的下調可促進AKT信號通路的激活，進而減少細胞凋亡，起到對肺組織的保護作用[48-49]。在神經系統疾病中，目前已知miRNA-451靶向調控p38MAPK，減輕腦微血管損傷、促進血管再生以及調節炎癥反應[50]；關于miRNA-451在疾病中的表達，一方面，在外傷性路腦損傷時，miRNA-451的表達升高[51]；另一方面，miRNA-451有希望成為腦卒中后認知障礙的一種分析指標[52]。然而關于miRNA-451作為缺血性腦卒中的生物標志物的可能性目前仍不清楚。

因此，我們探索了外周血外泌體源性的miR-451在缺血性腦卒中的潛在預測價值。在本研究中，我們分析了來自缺血性腦卒中患者和對照組的血液標本，由圖1可知，缺血性腦卒中的發病前后，外泌體源性miR-451的表達水平發生了變化。與對照組相比，缺血性腦卒中發病后，外泌體源性的miR-451表達顯著增加。此外，本研究分別計算缺血性腦卒中患者發病后第1天和第7天的ROC曲線，AUC均為1，表明人群中100%受試者被正確診斷，可見血清外泌體源性的miR-451有可能是一種優秀的缺血性腦卒中臨床診斷的生物標志物。

但由于本研究選取的樣本容量較少，如需廣泛的應用于臨床工作中，尚需更大規模的臨床試驗研究進行更深入的探討，明確外周血外泌體中miR-451作為缺血性腦卒中的臨床診斷指標的可能性。另一方面，本研究選取了缺血性腦卒中發病后的1天和7天兩個時間點，這兩個時間點中外周血外泌體中miR-451的表達無統計學意義，而在這段時間中miR-451的表達情況仍需進一步的深入探索。